益母草碱对心肌重构大鼠ACE2、AngⅡ及Ang1-7的影响研究

卢丽娜 陈浩 彭学勤 袁露 林昌洋 杨辉 魏国微 杨冬花△

(1.贵州省人民医院干医科；2.贵阳中医学院2017级研究生；3.贵州省人民医院病理科，贵州 贵阳 550002)

心力衰竭时肾素-血管紧张素系统(rennin angiotensin system ,RAS)激活，在心肌重构及心力衰竭的发生发展过程中起重要作用。近年发现的RSA新成员ACE2，可直接将AngⅡ转化生成Ang(1-7)，而Ang(1-7)具有抑制心肌重构的生物学功能[1]，因此，调节ACE2、AngⅡ、Ang(1-7)合成，已成为抑制心肌重构的作用靶点。在心衰的治疗中，中医药与西药具有协同作用，益气温阳、活血化瘀、利水为主要治疗方法[2]。课题组前期研究发现益气温阳活血方从多途径、多靶点抑制心肌重构[3]，益母草碱是益气温阳活血方的主要有效成分，前期研究进一步发现高剂量益母草碱(30 mg/kg/d)可减少慢性心力衰竭大鼠血清心房利钠肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、AngⅡ含量，抑制心肌重构[4]，但益母草碱是否可以通过影响ACE2、AngII、Ang1-7的浓度抑制心肌重构目前尚不明确。本研究通过观察益母草碱治疗后心肌重构大鼠血清及左心室肌组织ACE2、AngⅡ、Ang1-7浓度的变化，进一步探讨益母草碱抑制心肌重构的可能作用机制。报告如下。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物为SD雄性大鼠70只，由重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供，合格证号：SCXK(军)2012-0011；试剂与仪器为异丙肾上腺素(上海禾丰制药有限公司)，益母草碱(上海腾准生物科技有限公司)，DIZE(Sigma公司)，ACE2、Ang1-7ELISA试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司)，AngⅡ ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，CTGF、FN免疫组化试剂盒(北京博奥森公司)，心脏超声仪(PHILIPS-IE33)，酶标仪(北京新风机电公司)，倒置显微镜(Olympus公司)，石蜡包埋机(LEICA-EG1150H)。

1.2方法 (1)动物分组及治疗：70只健康SD雄性大鼠，体质量200±30g，在动物房同批饲养7 d后随机分为正常组8只和实验组62只。动物模型制备、分组及益母草碱给药剂量参考前期研究[5]：以异丙肾上腺素(5 mg/kg/d)连续2w腹腔注射诱导大鼠心肌重构模型，2周后实验组存活大鼠55只，以心脏超声评价心衰模型是否成功。将存活且造模成功大鼠50只随机分五组：模型组、DIZE组、益母草碱低剂量组(低剂量组)、益母草碱中剂量组(中剂量组)、益母草碱高剂量组(高剂量组)，每组10只。各组干预治疗方法：DIZE组予DIZE 15mg/kg/d腹腔注射，益母草碱低、中、高剂量组分别予益母草碱7.5 mg/kg/d、15 mg/kg/d及30 mg/kg/d腹腔注射，正常对照组和模型组给予相同体积生理盐水腹腔注射，每日1次，共干预治疗2周。(2)试验结束后以超声心动图检查：以5%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定，剃净胸毛，以PHILIPS-IE33超声仪，频率12.0MHz超声探头检测各组大鼠LVEDd、LVEDs、FS%、EF%，取3个连续心动周期测量平均值。(3)血清及心肌组织ACE2、AngⅡ、Ang 1-7含量检测：采集颈动脉血，取血清于-70℃冰箱保存；处死大鼠，取心肌组织液氮冻存，将冻存的心肌组织按10 %(重量体积)加入预冷生理盐水，快速剪碎，匀浆器碾磨，以4℃3 000r/min离心20min，取上清液于-70℃冰箱保存，同批与血清以ELISA法检测各组ACE2及AngⅡ、Ang 1-7水平，操作按试剂盒说明进行。(4)HE染色：取左心室肌组织，以10%甲醛固定，石蜡包埋，切片后脱蜡，行HE染色，脱水封片，在显微镜下观察心肌组织形态。(5)Masson染色：取左心室肌组织，以10%甲醛固定，石蜡包埋，切片后脱蜡，进行Masson染色，染色后心肌胶原纤维呈蓝色，在显微镜下取5个视野平均值，用图像分析软件ImagePro Plus 6.0计算CVF值，CVF(%)=心肌胶原面积/照片面积×100%。(6)免疫组织化学法观察左心室肌组织CTGF、FN的表达：取0.5×0.5 cm2大小左心室肌组织，以10%甲醛固定，石蜡包埋、切片、脱蜡、复水、煮沸法修复，按照SP法免疫组化试剂盒说明操作，CTGF、FN一抗按1:300稀释，PBS代替一抗作为空白对照。在显微镜下取5个视野平均值，用图像分析软件ImagePro Plus 6.0测量平均光密度，平均光密度(%)=积分光密度/照片面积×100%。

2 结 果

2.1心脏超声检测 结果与正常组比较，其他各组大鼠LVEDd、LVEDs值升高，而FS%、EF%值下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，DIZE组、益母草碱高剂量组LVEDd、LVEDs值明显下降，而FS%、EF%值明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，LVEDd、LVEDs、FS%、EF%在DIZE组和益母草碱高剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1 各组大鼠心脏超声检测值

图1 各组大鼠心脏超声结构变化

2.2心肌组织HE染色 正常组心肌细胞大小正常，排列规整，结构清晰，细胞核大小形态正常，细胞间质无水肿，无明显纤维增生；模型组心肌细胞肥大，形态结构模糊，肌纤维溶解，细胞排列紊乱，见明显纤维增生及炎性细胞浸润；DIZE组及高剂量益母草碱组心肌细胞形态较清晰，排列较规整，纤维增生及炎性细胞浸润明显减少；而益母草碱低、中剂量组与模型组比较变化不明显。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织HE染色(×200)

2.3心肌组织Masson染色 经Masson染色显示心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色，正常组细胞间无明显胶原纤维沉积，心肌细胞排列整齐，结构清晰；模型组见大量胶原纤维增生，呈网状交织、堆积成团成片，心肌细胞肿胀，结构模糊，排列紊乱；DIZE组及高剂量益母草碱组胶原纤维增生明显减少，心肌细胞形态结构较清晰。与正常组比较，其他各组大鼠CVF明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，DIZE组、益母草碱高剂量组CVF明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；CVF在DIZE组和益母草碱高剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表2。

图3 各组大鼠心肌组织Masson染色(×200)

2.4心肌组织CTGF、FN蛋白质表达水平的检测 与正常组比较，其他各组大鼠心肌组织CTGF、FN蛋白质表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，DIZE组、益母草碱高剂量组CTGF、FN蛋白质表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；CTGF、FN在 DIZE组和益母草碱高剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图4-5。

表2 各组大鼠心肌组织CVF及CTGF、FN蛋白质表达水平的检测

图4 各组大鼠心肌组织CTGF表达(×200) 图5 各组大鼠心肌组织FN表达(×200)

2.5血清及左心室肌组织ACE2、AngⅡ、Ang 1-7含量检测 与正常组比较，其他各组大鼠血清及左心室肌组织ACE2、AngⅡ、Ang1-7含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，DIZE组、益母草碱高剂量组ACE2、Ang1-7含量明显升高，AngⅡ含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；ACE2、AngⅡ、Ang 1-7在DIZE组和益母草碱高剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清及心肌组织AngⅡ、ACE2、Ang 1-7的含量

3讨 论

心肌重构是多种心血管疾病发展至心力衰竭的基本病理机制，是在多种生长因子、激素刺激下出现的心肌细胞结构及功能改变，主要表现为心肌细胞肥大、凋亡、细胞外基质的过度纤维化[6]。生长因子CTGF可刺激成纤维细胞增殖及胶原沉积，促进心肌纤维化及心肌重构[7]，FN是重要的细胞外基质，也有促进心肌纤维化及心肌重构的作用[8]，CTGF和FN是心肌纤维化的重要病理学标记物。

本研究通过异丙肾上腺素诱导心肌重构大鼠模型，心脏超声结果显示其LVEDd、LVEDs升高，FS%、EF%下降，大鼠心脏结构发生改变，心脏功能下降；HE染色见心肌细胞肥大或固缩、排列紊乱，Masson染色见胶原纤维明显增生，免疫组化显示CTGF、FN蛋白质的表达水平明显升高，从影像学及病理形态学提示造模成功。为观察益母草碱对心肌重构是否有抑制作用，本研究予益母草碱低、中、高剂量(7.5 mg/kg/d、15 mg/kg/d、30 mg/kg/d)进行干预治疗，结果发现，高剂量益母草碱干预后大鼠心脏LVEDd、LVEDs明显下降，FS%、EF%明显升高，提示高剂量益母草碱可改善心肌重构大鼠心脏结构和功能异常；经HE染色和Masson染色结果显示高剂量益母草碱组心肌组织心肌的细胞形态结构较清晰，胶原纤维增生明显减轻，且免疫组织化学检测显示CTGF、FN蛋白质的表达水平也明显下降，提示高剂量益母草碱可改善大鼠心肌重构病理形态学异常。本研究结果还显示，高剂量益母草碱组大鼠血清及心肌组织AngⅡ含量明显降低，而ACE2、Ang1-7含量明显升高，综合影像学、病理学检查结果，与ACE2内源性激动剂DIZE组效应一致。心衰时RAS系统的激活是引起心肌重构的重要原因，AngⅡ水平升高，可直接刺激心肌细胞增殖肥大和醛固酮分泌增加，进一步加重水钠潴留、促进胶原合成及心肌纤维化。AngⅡ作为刺激因子，还可激活(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信号通路，p38MAPK是MAPK信号通路的重要途径，激活后可致心肌细胞肥大、细胞凋亡失调，引起炎性反应、成纤维细胞活化，促进心肌重构[9]。ACE2是2000年发现的RAS新成员，与ACE具有较高的同源性[10]，它是RAS系统重要的负调控因子，在心脏心肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等均有表达，可催化AngⅡ生成Ang1-7，而Ang1-7与其特异性抗体Max结合发挥拮抗AngⅡ的生物学效应[11]。研究[12]发现，心力衰竭时ACE2水平升高，且心衰程度越重，ACE2水平越高，虽然ACE2升高，但同时ACE升高更加显着，ACE/ACE2比值升高，ACE2不足以对抗ACE对心肌的毒害作用[13]。结合本研究模型组ACE2水平升高，推测在心肌重构发生过程中，ACE2升高作为一种代偿机制，刺激Ang1-7水平进一步升高，但此时升高的水平不足以对抗ACE-AngⅡ-AT1轴的不利作用。DIZE作为ACE2的内源性激活剂，本实验予DIZE干预治疗后，ACE2及Ang1-7水平进一步升高，产生了可以和ACE-AngⅡ-AT1轴相平衡的效应，心肌重构得以改善，高剂量益母草碱具有和DIZE相同的干预治疗效果。

现有的研究证实，Ang1-7抑制MAPK信号通路，降低心肌组织p38MAPK的蛋白磷酸化水平[14]，从而抑制心肌重构[15]。课题组前期研究发现，高剂量益母草碱可通过抑制p38MAPK信号通路逆转心肌重构[5,16,17]，结合本研究结果及前期研究，推测高剂量益母草碱抑制大鼠心肌重构，其机制可能与升高ACE2水平转化AngII生成Ang1-7，进而抑制p38MAPK信号通路活化有关，具体机制有待进一步研究。