系列微生物快速测试瓶技术在长庆油田的应用*

万云洋 徐飞艳 王洪关 李文宏 刘利平 郭子龙

(1.中国石油大学(北京)油气资源与探测国家重点实验室，地层微生物资源与应用研究中心，油气污染防治北京市重点实验室，非常规油气科学技术研究院；2.中国石油长庆油田分公司勘探开发研究院，低渗透油气田勘探开发国家工程实验室；3.中国华油集团北京华油科隆开发公司；4.中国石油长庆油田分公司第五采油厂；5.中国石油长庆油田分公司第四采油厂)

0 引 言

由于微生物学近年来的快速发展[1]，长庆油田微生物驱油技术已在近年来迅速发展，2014年以来逐步推广到全油区千余口井(并将更大规模推广和开展微生物技术在油田的应用研究)，注水井平均吸水厚度增加0.5 m，储量动用程度提高4.7%，整体地层压力呈上升趋势，开发指标变好，水驱状况明显改善。

由于微生物具有环境敏感性、油藏微生物多样性高[1-2]的特点、油田地区分散、现场作业条件艰难、工作量大和人员基本不具备微生物学知识，针对长庆油田6 000万t上产增储目标，随着长庆油田微生物活化水驱现场规模逐步增大，为适应现场需求，亟需开发快速、简便、可操作性强的微生物检测方法。测试瓶技术因其原理简单、稳定可靠得到广泛认可和推荐[3-4]。本研究开展基于中国石油大学(北京)研制、北京华兴试剂厂生产系列微生物测试瓶测试结果的可靠性。

1 材料与方法

1.1 测试材料

测试瓶：华兴系列测试瓶纤细竿菌(XXG)、铜绿假单胞菌(PMA)、脱硫化弧菌(DSV)、肠杆菌(EBX)、腐生菌(TGB)、硫酸盐还原细菌(SRB)和铁细菌(IB)(北京华兴试剂厂，2019年)。1 mL一次性无菌注射器；酒精灯或75%酒精；棉签；无菌医用口罩；乳胶手套；蒸馏水等。

1.2 测试样品

纯菌样品。中国石油大学(北京)自主分离纯化菌种铜绿假单胞菌和纤细竿菌[5](分离自长庆油田)，辽河中石大脱硫化弧菌(分离自辽河油田)。

混合样品。油田混合样品采自长庆油田某区块11口采油井井头产出液共11份。

上述所有样品均分成3份，平行测试。

1.3 测试方法

基于出厂使用指南，样品进行各类测试瓶的快速检测。简单的说，按无菌操作方式，抽取1 mL待测试液体(水样、油样或油水混合液)，分别注入9 mL测试瓶中，按绝迹稀释法依次10-1，10-2……10-10梯度稀释[6]，35℃恒温恒湿(50%RH)避光培养1～7 d，连续观察，每天记录测试瓶色度和浊度变化，其中硫酸盐还原细菌(SRB)测试14 d；腐生菌(TGB)、铁细菌(IB)、脱硫化弧菌(DSV)和肠杆菌(EBX)检测7 d；铜绿假单胞菌、纤细竿菌(枯草芽孢杆菌)检测3 d。每样三平行。

2 结果与讨论

2.1 纯菌检测及测试瓶技术原理

XXG、PMA测试瓶是为油田现场复杂环境快速检测纯菌和该类微生物专门设计的，其原理是逐级梯度稀释、微生物代谢物与测试瓶指示剂显色反应、颜色/色度以及反应时间，表示了菌种数量、类型和活性见图1和表1。

注：由于样品差异、菌株差异和肉眼观察差异，数量和色度仅供标准化参考，菌浓仍以绝迹稀释法测定为准。图中显色为中国石油大学(北京)微生物地质学实验室典型颜色反应。

表1 三种典型油藏菌种测试瓶测试结果

硫酸盐还原菌(SRP)数量较多，其中对产生硫化氢有最大贡献的当属脱硫化弧菌属[7]。脱硫化弧菌(DSV)测试瓶即是为油田现场这类硫功能菌专门设计的，其原理是通过逐级梯度稀释法，新物质生成、黑色或浊度(絮状)变化及反应时间表示了菌群、数量和活性。7 d内非常明显的展示了此类极强SRP的显色和数量关系，见图2和表1。

图2 测试瓶对样品微生物及混合样品的典型显色反应

2.2 测试瓶对混合液(采出液)稳定性分析

基于对纯菌的成功测试，测试瓶的稳定性和有效性还需要考虑混合条件下对此类菌是否有特征响应性。本文对长庆油田某区块11口采油井产出液(每样三平行)进行现场测定，见表2。很明显，几类测试瓶均对现场11份样品测试稳定，未呈现(不干涉)目标菌的特征；DSV和SRB对应关系明显，所有检测数量均符合SRB>DSV；但TGB测试瓶显示效果不佳，腐生菌(杂营非寄生菌)[6]检出低于XXG检出，甚至低于IB检出见表2。

表2 各类测试瓶对油田现场混合液(产出液)的稳定性测试结果(10n)a

从绝对数量来看，证实了实物目测结果见图2，1～5和8号数量偏低，8号最低，7，9，10号菌量最高。1，6和11号由于样品耗尽，评价不完整，其中6号目测颜色也深，但DSV和EBX指标显示很低，说明此井受到人为和外界环境的干扰与5号类似，较少。TGB的7 d试验证实其对总菌(腐生菌)检测存在缺陷，一定程度上可用XXG-3取代。EBX数据显示，大部分采油井已经受到人为干扰。铁细菌(IB)可能是地层水中本源存在的，但对铁氧化菌的识别较低。判识1～11号总菌数的顺序依次是：7，10，9>4，3>2，11>5，8，虽然1号和6号缺少数据，但从仅有的指标来看，微生物量不会太高。

3 结 论

总体而言，所用测试瓶取得了对纯菌和混合液(产出液)的良好效果，通过颜色和浊度变化、绝迹梯度稀释检测目标微生物数量类型，结合色板比对法，认为(1)所有测试瓶都有特征响应性，互不干扰。(2)除TGB外，SRB，DSV，EBX，XXG，PMA和IB测试瓶对现场混合液微生物检测有很好的响应，同一个样品的3个平行测试结果一致，具有很好的重复性、特异性和专一性。(3)同时，由于DSV型测试瓶对脱硫化弧菌类的敏感响应，适合快速检测，是SRB测试瓶的有力补充和升级。(4)XXG和PMA无论对于纯菌或混合液，只要存在该类菌，都有特征响应，敏感度高。(5)一定程度上，XXG可以作为异营细菌量的评估，而PMA可以作为荧光细菌的快速评估。各类测试瓶对纯菌和现场混合液检测效果良好，特征唯一性、稳定性和数量关系好，检测快速，满足实际需求，建议进一步加大加快规模化测试。

由于微生物特别是细菌和古菌对于环境的敏感性，测试瓶技术对于环境样本中处于少量或弱势/弱活性的菌的检出不太高，本文建议进一步加强TGB、SRB和IB三大测试瓶深入研发，并适度开展基于目标定位的其它类型测试瓶研发，以满足现场快速检测需求。