一种芽孢杆菌广谱细菌素的分离纯化及其性质研究*

张海林 刘占燕 张梦宇 谭可心 张礼丛 张玉然

(济宁医学院生物科学学院，日照 276826)

细菌素是一类由细菌核糖体编码合成，对同种亲缘的微生物具有高效抑制的一类多肽或前体多肽[1]，绿色环保、安全高效，被视为抗生素的理想替代品。乳酸链球菌素(Nisin)是唯一通过FDA/WHO双认证，商业化应用于食品领域的细菌素。Nisin在碱性条件下不稳定，以及仅能抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌和真菌等抑制作用效果较差[2]等因素，限制了其应用范围。芽孢杆菌可以代谢产生多种细菌素，与Nisin相比，大部分芽孢杆菌细菌素具有耐高温、耐酸碱、广谱抑菌的特性[3-4]，具有较高的应用前景。

本文拟从高温酒曲中筛选产细菌素的芽孢杆菌，研究其生物学特性，拟开发一种在食品、医药领域具有应用价值的细菌素。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1样品来源 高温酒曲，由山东梁山县儒匠酒曲有限公司提供。

1.1.2菌株 指示菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26112)。实验菌：大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)，铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853)，白色念珠菌(Candida albicans ATCC14053)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae CMCC 51252)，黑曲霉ATCC16404。以上菌株均由济宁医学院生物科学实验中心提供。

1.1.3主要仪器与试剂 全温叠加式摇床(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)；PCR仪(BIO-RAD公司)；电泳仪(北京六一公司)；全自动免染凝胶成像分析系统(BIO-RAD公司)。

LB培养基(上海生工生物工程有限公司)；细菌基因组DNA抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；TaqDNA聚合酶(北京宝日医生物技术有限公司)；蛋白酶K(北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)；PageRuler 预染蛋白分子(上海赛默飞世尔科技有限公司)；其它试剂均为日照国药分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1产细菌素芽孢杆菌的筛选 将10ml无菌水中加入1g高温酒曲，于70℃保温30min，取5ml悬浮液于LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养24h。稀释适当倍数涂布于LB平板，于37℃培养24h。挑选单菌落菌株接种于LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养24h。8×103rpm离心去菌体，发酵上清液中缓慢加入固体硫酸铵，至其终浓度为60%，并置于4℃冰箱中隔夜处理，再经1×104rpm离心10min，获得盐析沉淀，并将其溶于原体积1/50的0.02mol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液中，制成细菌素溶液，进行抑菌活性测定。

1.2.2产细菌素芽孢杆菌的种属鉴定 参考文献方法[5-6]，以细菌基因组DNA抽提试剂盒提取的菌株基因组DNA为模板，采用16S区通用引物27F/1492R，进行PCR扩增。PCR体系：菌基因组DNA提取物0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP Mixture 2μl，引物27F/1492R对各1μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，补无菌水至25μl。PCR反应条件：94℃ 预变性3min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸90s，循环扩增34个循环；72℃延伸7min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测得的16S rDNA基因序列在NCBI网站上进行同源性比对，鉴定菌株种属。

1.2.3细菌素的分离纯化 将发酵液加热至100℃，保温5min，1×104rpm离心10min，留上清，调节pH为2.0使蛋白絮凝沉淀，1×104rpm离心10min。将获得的蛋白沉淀溶于原体积1/50的0.02mol/L pH 7.0磷酸钠盐缓冲液中，而后加入固体硫酸铵，至其终浓度为8%，4℃冰箱静置2h，1×104rpm离心10min，将获得的蛋白沉淀溶于等体积0.02mol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液中。重复上述盐析步骤2次，将得到的细菌素溶液按1.3.2中Tricine-SDS-PAGE方法进行电泳。

1.2.4细菌素对pH、温度、蛋白酶耐受性的测定 将纯化的细菌素溶液pH分别调节为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0，然后置于37℃处理4h，再将pH调至7.0，按1.3.1方法测定抑菌活性。

将纯化的细菌素溶液，分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下处理30min，以及100℃、110℃、120℃分别处理10min、20min、30min，按1.3.1方法测定抑菌活性。

向0.2ml纯化的细菌素溶液中(预先调整至各个酶的最适合pH，胃蛋白酶样品pH 2.5)，分别加入0.05ml浓度为5mg/ml的蛋白酶溶液(胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶)，然后置于37℃处理6h，再将pH调至7.0，按1.3.1方法测定抑菌活性。以未加蛋白酶处理的样品为对照。

1.3 检测方法

1.3.1细菌素抗菌活性的测定 采用双层琼脂牛津杯法[7]，指示菌(金黄色葡萄球菌)菌浓为1×106CFU/mL。通过测定抑菌圈直径大小(mm)，表观细菌素抑菌活性。

1.3.2凝胶原位电泳活性检测 参考Schagger的Tricine-SDS-PAGE方法[8]，在凝胶两侧平行上样，电泳结束后，将凝胶一分为二。一半用于染色，另一半置于1% Triton X-100溶液中，振荡20min，并水洗2次，去除凝胶中SDS，再以0.1mol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液浸泡平衡10min，然后转移至无菌培养皿中，加入20ml含指示菌(菌浓为1×106)LB培养基(含0.7%琼脂，45℃)，待其完全凝固后，于37℃培养24h，观察抑菌圈位置。

2 结果和讨论

2.1 菌株的鉴定

从高温酒曲中分离得到一株芽孢杆菌PL-2，其发酵液经60%硫酸铵盐析得到的蛋白质溶液，经双层琼脂牛津杯法检测，可显著抑制指示菌生长。PL-2菌株16S rDNA序列比对结果见表1。

表1 基于菌株PL-2 16S rDNA序列的比对分析

经16S rDNA序列比对，LP-2菌株鉴定为Bacillus velezensis，命名为Bacillus velezensis PL-2。

2.2 细菌素的纯化及活性鉴定

经高温煮沸、pH沉淀、盐析等步骤，得到纯度较高的蛋白质溶液，然后利用Tricine-SDS-PAGE电泳以及凝胶原位电泳抑菌活性检测方法，检测其纯度和抑菌活性。与Tricine-SDS-PAGE电泳条带相对应的位置处出现指示菌抑菌圈，证明该条带蛋白具有抑菌能力，可初步确定Bacillus.velezensis PL-2产生的抑菌物质为细菌素(蛋白类物质)，分子量约10kDa，而非有机酸、过氧化氢等。B.velezensis PL-2发酵液只需经过简单的纯化步骤，即可获得纯度较高的细菌素，有利于后续规模化提取。见图1。

2.3 细菌素的pH稳定性

分别调整细菌素溶液pH并于37℃条件下维持4h，采用双层琼脂牛津杯法，分析其抑菌活性的变化。在pH 3.0～14.0范围内，抑菌活性变化均很小，最大降幅为5%。当pH为2.0时，细菌素发生絮凝沉淀，但沉淀复溶后仍能完全保留其抑菌活性。B.velezensis PL-2生产的细菌素具有宽泛的pH耐受性。见图2。

注：泳道，1,3-marker，2,4,5-纯化的细菌素图1 细菌素的Tricine-SDS-PAGE电泳图和凝胶原位电泳抑菌活性检测图

图2 细菌素的pH稳定性

2.4 细菌素的热稳定性

pH 7.0条件下，分别以不同温度对细菌素进行处理，分析其抑菌活性的变化。分别以30℃～100℃温度处理细菌素溶液，其抑菌活性基本维持不变；110℃、120℃处理30min，均未见蛋白絮凝析出，其抑菌活性仅分别降低10%和18%。B.velezensis PL-2生产的细菌素具有很强的温度耐受性，为其在食品、医药等领域的应用奠定基础。见图3。

图3 细菌素的热稳定性

2.5 细菌素的蛋白酶稳定性

分别以不同的蛋白酶处理细菌素，以未加蛋白酶的细菌素样品为空白对照，分析蛋白酶对其抑菌活性的影响。目前报道的细菌素中，大部分因不能抵抗蛋白酶K、胃蛋白酶的降解而丧失抑菌活性，而B.velezensis PL-2产的细菌素均能抵御蛋白酶K、胃蛋白酶等5种蛋白酶的水解，保持较高的抑菌活性。因其具有较强的蛋白酶稳定性，可初步判断为一种抗酶解细菌素。见图4。

图4 细菌素的蛋白酶稳定性

2.6 细菌素的抑菌菌谱

采用双层琼脂牛津杯法，分析B.velezensis PL-2生产的细菌素对不同菌属菌株的抑制活性。B.velezensis PL-2生产的细菌素具有广谱抑菌特性，即可抑制革兰氏阴性菌，也可抑制革兰氏阳性菌，对真菌(白色念珠菌、黑曲霉)也具有较强抑制活性，但对大肠杆菌没有抑制作用，有待进一步研究。见表2。

表2 细菌素抑菌菌谱

3 结论

B.velezensis是芽孢杆菌属一个新种，直至2005年才被报道和正式命名，但其在抑制病原菌和生物防治方面具有显著的优点，已成为关注的焦点。本文中B.velezensis PL-2菌株产生的细菌素分子量约为10kDa，具有贝莱斯芽孢杆菌细菌素共有特性(广谱抗菌特性)。相对于文献报道的B.velezensis 菌株产生的细菌素[9-10]，该细菌素具有较强的热稳定，可耐受100℃高温，即使在120℃高温下处理30min，其抑菌活性也仅降低18%。此外，该细菌素既可耐受强酸环境，也可耐受强碱的环境，宽泛的pH耐受性也优于目前文献报道的贝莱斯芽孢杆菌细菌素。后续可对该细菌素的生理毒性进行研究，开发其在食品加工、生物医药领域的应用。

志谢:在研究过程中，山东梁山县儒匠酒曲有限公司提供高温酒曲，济宁医学院生物科学实验中心提供实验场所及相关设备，保障了本研究的顺利进行，特此表示感谢。