血清新型冠状病毒 IgM抗体检测结果分析及临床价值探讨

谷 斌，黄慧琴，鲁 爽，黄文学，肖三平

湖南省郴州市第二人民医院：1.肝病中心；2.检验科，湖南郴州 423000

随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球蔓延，高效、快速、准确的实验室诊断技术是确保患者尽早收治、阻止疫情发展的关键环节。实时荧光定量PCR(qPCR)检测核酸阳性一直是COVID-19临床确诊的最主要指标。随着人们对qPCR局限性认识的逐渐提高，确诊标准已经从最初单一的病原学证据转变为病原学结合血清学证据[1-2]。研究者积极研发新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgM检测试剂盒，筛选潜在的病毒阳性感染者，尽快隔离感染人群，为阻断病毒传播发挥了极大的作用[3-4]。2020年2月22日国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第二版)》[5]指出，SARS-CoV-2抗体检测可作为COVID-19感染的辅助诊断。本研究采用胶体金免疫层析技术对SARS-CoV-2 IgM抗体进行检测，以探讨SARS-CoV-2 IgM抗体对COVID-19感染的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年2月12-18日本院门诊和住院患者共175例为研究对象，其中，COVID-19确诊住院患者23例，非COVID-19住院患者70例，非COVID-19发热门诊就诊患者82例；男109例，女66例；年龄2～85岁，平均(43.4±15.5)岁。依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》[6]，确诊病例具备SARS-CoV-2病原学证据。本研究纳入的所有病例均通过qPCR方法检测患者咽拭子标本中SARS-CoV-2核酸，COVID-19病例23例，非COVID-19病例152例。本研究通过本院伦理委员会审批，批号：(2020)临伦审第(1)号，并批准予以豁免患者知情同意。

1.2试剂与仪器 病毒RNA提取试剂盒、qPCR试剂均为湖南圣湘生物科技股份有限公司提供(注册证编号：国械注准20203400064)，荧光定量扩增的基因为SARS-CoV-2 ORF1ab基因和N基因，采用上海宏石医疗科技公司提供的SLAN-96P荧光定量仪进行qPCR扩增。SARS-CoV-2 IgM抗体检测试剂盒由北京热景生物技术股份有限公司提供(生产许可证编号：京食药监械生产许20070010，生产日期2020年02月02日)，包被的抗原为SARS-CoV-2真核抗原S蛋白，包括S1蛋白和S-RBD蛋白抗原。

1.3标本来源 所有研究对象均采集空腹静脉血5 mL，置于红头真空采血管内，静置待血液凝固，3 000 r/min离心5 min，所有患者取1份血清标本备用。采集研究对象咽拭子2份标本(间隔1 d以上)，进行SARS-CoV-2核酸检测。

1.4试验方法 SARS-CoV-2 IgM抗体检测采用胶体金免疫层析技术，SARS-CoV-2核酸检测采用PCR荧光探针法，所有操作严格按照《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第二版)》[5]操作标准和试剂盒操作指南进行。依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》[1]，以SARS-CoV-2核酸检测法作为“金标准”，对IgM抗体检测的结果进行统计，分析IgM抗体检测的阳性率、检测时间、灵敏度和特异度等。

2 结 果

2.1SARS-CoV-2 IgM抗体检测结果与SARS-CoV-2核酸检测结果 175例患者SARS-CoV-2 IgM抗体检测阳性者30例，阴性者145例，阳性检出率为17.14%。175例患者中COVID-19患者23例。30例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性患者中，COVID-19患者15例，非COVID-19患者15例；145例SARS-CoV-2 IgM抗体阴性患者中，COVID-19患者8例，非COVID-19患者137例，见表1。15例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性非COVID-19患者来自于发热门诊9例，慢性乙型肝炎1例，艾滋病2例，继发性肺结核1例，吸毒1例，尿毒症1例。

表1 SARS-CoV-2 IgM抗体检测与SARS-CoV-2核酸检测结果比较(n)

2.2SARS-CoV-2 IgM抗体检测的灵敏度、特异度 SARS-CoV-2 IgM抗体检测的灵敏度为65.22%(95%CI=58.16%～72.28%)，特异度为90.13%(95%CI=85.72%～94.54%)。

2.323例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸检测距离起病时间 剔除2例无症状COVID-19患者，21例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸检测距离起病时间为1～13 d，其中1～5 d 8例，>5～10 d 9例，>10～13 d 4例，检测时间中位数为6 d。

2.423例COVID-19患者SARS-CoV-2 IgM抗体检测距离起病时间 剔除2例无症状COVID-19患者，21例COVID-19患者SARS-CoV-2 IgM抗体检测距离起病时间为3～21 d，其中3～7 d 5例，>7～14 d 8例，>14～21 d 8例,检测时间中位数为12 d。13例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性者抗体检测距离起病时间为5～21 d，其中5～7 d 2例,>7～14 d 6例,>14～21 d 5例，检测时间中位数为13 d。8例SARS-CoV-2 IgM抗体阴性者抗体检测距离起病时间为3～19 d，其中3～7 d 3例，>7～14 d 2例，>14～21 d 3例,检测时间中位数为10 d。

经t检验，21例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸检测与SARS-CoV-2 IgM抗体检测距离起病时间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。13例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性者与8例SARS-CoV-2 IgM抗体阴性者抗体检测距离起病时间比较，差异无统计学意义(P=0.576)。

3 讨 论

COVID-19作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理，严重威胁到人们的生活、生命健康[7]。尽管qPCR核酸检测在临床诊断中发挥了重要作用，但限于技术和操作复杂等因素，检测时间一般需耗时5～6 h，导致患者在医院就诊等待时间较长，增加了患者在医院交叉感染的风险，不适用于快速诊断，也不能完全满足当前排查诊断的检测需要，并且由于大体积反应系统和非特异性扩增，可能会增加假阳性[8]。另外，受到标本采集(时间、部位、类型)、标本运输和保存、检测试剂等方面的影响，可能造成检测结果假阴性。因此，探索更快、更便捷、更多的检测方法是疫情防控中的重要任务。人体感染 SARS-CoV-2后，会激活人体免疫系统，产生针对性IgM抗体，《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第二版)》[5]提出采用血清标本进行抗体检测的要求。抗体检测是病毒感染的重要诊断方法，标本来源于外周血、血清或血浆标本，其采集和保存简单易行，可大大降低医护人员因采集咽拭子感染的风险。SARS-CoV-2感染后，患者核酸转阴后抗体亦可继续存在，抗体检测对于SARS-CoV-2疫情的回顾性诊断和流行病学调查亦具有重要意义。因此，在临床上开展抗体检测势在必行。

本研究对胶体金免疫层析技术检测SARS-CoV-2 IgM抗体进行临床性能验证。该试剂盒包被的抗原为SARS-CoV-2真核抗原S蛋白，包括S1蛋白和S-RBD蛋白抗原。S蛋白是SARS-CoV-2的主要蛋白之一，其编码基因可用于病毒分型，作为诊断抗原。免疫检测是目前常用冠状病毒检测和诊断的方法[9]，免疫层析法为早期诊断冠狀病毒感染的方法之一[10]。本实验应用捕获法检测血液标本中的SARS-CoV-2 IgM 抗体，通过与胶体金固定的S蛋白特异结合，达到检测目的。该方法操作简单、快捷，成本低廉，无需特殊设备，易推广，在当前复工大潮筛查中可以发挥重要作用。

本组资料显示，SARS-CoV-2 IgM抗体检测灵敏度为65.22%，提示检出COVID-19感染的能力不足，需要结合其他检测手段和临床表现来判断；特异度为90.13%，提示判断无COVID-19感染的能力较好，可用于临床初筛COVID-19感染，抗体阴性者患COVID-19疾病的可能性不大，结合临床表现和流行病学史可以初步排除COVID-19，可以作为临床COVID-19 筛查和诊断的必要补充。据文献报道，流感病毒抗原胶体金检测方法的灵敏度为55.6%，特异度为75.9%[11]。另有文献报道，SRAS-CoV IgM抗体检测的灵敏度为52.80%,特异度为99.40%,诊断符合率为78.82%[12]。因此，抗原-抗体检测方法灵敏度低、特异度强的特点较为显著，与本组研究观察一致。抗原-抗体检测灵敏度较低的原因可能与标本采集时间点和抗体产生的生理过程相关。其次，本试验IgM抗体检测采用捕获法，灵敏度偏低，当标本中抗体滴度较弱时，可能出现IgM试剂未能检出。故有必要对SARS-CoV-2 IgM抗体的灵敏度进行深入的研究，增加试剂包被片段，扩大检测位点，提高抗体检测对COVID-19的诊断率。

由于该检测体系采用了鼠抗人IgM单抗捕获人血中的IgM抗体，标志物的靶标为人IgM，而不仅仅是SARS-CoV-2 IgM，存在一定的非特异性反应。主要影响因素有慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、结核病、自身免疫性肝病、系统性红斑狼疮、类风湿疾病、严重感染或经过抗体药物治疗，以及有啮齿类动物接触史等，在这些患者中可能出现交叉反应，导致假阳性，因此，病史采集时需要特别关注这些信息。抗体检测假阳性可能与试剂盒本身检测差异有关，也可能与SARS-CoV-2的感染机制有关，有待进一步研究。

本组资料显示，SARS-CoV-2 IgM抗体检测距离起病时间为3～21 d，检测时间中位数为12 d。剔除2例无症状核酸筛查阳性者，13例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性者抗体检测距离起病时间为5～21 d，检测时间中位数为13 d,其中>7～14 d 8例,>14～21 d 8例。 提示SARS-CoV-2 IgM抗体在发病5 d后可以检出，>7～21 d IgM抗体检测的阳性率较高，推测IgM抗体检测的最优时间点为发病后第8天，而核酸检测的最佳时间为3～5 d[13]，可见核酸检测时间更早。SRAS-CoV感染发病后第10～20天的血液中检测特异性IgM抗体阳性率升高，与SARS-CoV-2 IgM抗体检测时间相近。抗体产生可能与病毒感染机体的特殊致病机制、潜伏期等因素有关[14]，提示SARS-CoV-2 IgM抗体检测是对核酸阴性的重要补充，可用于COVID-19感染的筛查和辅助诊断，并对病毒感染急性状态进行评估，但还需要进一步对血清特异性抗体消长和持续时间进行研究。

21例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸检测和SARS-CoV-2 IgM抗体检测距离起病时间比较,差异有统计学意义(P<0.01)，与病毒核酸产生早和针对病毒的抗体产生时间不同、持续时间不一致有关，提示不同类型标本采集时间不同可能导致检测结果不一致。

综上所述，抗体血清学检测的标本来源于外周血、血清或血浆，其采集和保存简单易行，特异度较高，判断无COVID-19感染的能力较好，可用于临床初筛COVID-19感染。因此，SARS-CoV-2 IgM抗体检测对核酸检测容易漏检的问题是很好的补充，将在COVID-19的诊断、治疗监测和病程转归等方面提供更多的临床数据。本研究仅为初步探索，纳入病例数较少，且标本连续性不足，不同类型标本采集时间不同可能导致检测结果不一致，有必要对SARS-CoV-2 IgM抗体产生的规律性和检测的准确性进行深入研究，为COVID-19提供更多的临床数据。