基于微滴式数字PCR的饮料中嗜酸乳杆菌定量检测

刘洋，张娜娜，窦同海，俞漪，徐琼，曲勤凤，赵渝，杨捷琳，朱春梅

(1. 上海市质量监督检验技术研究院国家食品质量监督检验中心(上海)，上海200233；2.上海昂朴生物科技有限公司，上海201114；3.上海师范大学生命科学学院，上海200234；4.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海200135；5.杜邦营养与生物科技丹尼斯克（中国）投资有限公司，上海200335)

0 引 言

嗜酸乳杆菌作为重要的益生菌被广泛用于食品中。Kumar[1-4]等人发现嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、腹泻致病菌等均有抑制作用；降低血浆中胆固醇含量[5]；对乳糖不耐症有一定的疗效[4，6]，对机体健康有促进作用等[5，7]。嗜酸乳杆菌能在发酵过程中产生乳酸，并通过氨基酸代谢增加风味[8]。在我国，饮料中添加益生菌特别是嗜酸乳杆菌成为新的发展趋势[8]。

微滴式数字PCR 技术（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是近年来新发展起来的定性定量分子检测新方法[9]，用于转基因成分、食品中致病菌、掺假产品等的检测，以及在临床上用于肿瘤细胞的检测[10-16]。1992 年，Sykes[17]等就首次提出了ddPCR的构想，是一项基于单分子目标基因PCR 扩增的绝对定量技术，主要原理是将含有DNA 模板的PCR 反应体系分布到大量的独立反应室，单分子间通过大量稀释后分离，使得每个独立反应室中含有小于或等于一个拷贝，然后使这些反应室在相同条件下独自进行PCR 扩增[18-19]。含有DNA 分子的微反应室能够发生PCR 反应，即产生阳性信号；而不含DNA 的微反应室则产生阴性信号[18，20]，再利用泊松分布，逐一对阳性信号的微反应室计数，从而计算出样品中初始的DNA 模板量[21]。

ddPCR 技术以其准确性好、灵敏度高、无需任何校准物质、可进行绝对定量等优势，已经在临床诊断、基因表达、环境微生物检测等方面得到了广泛的研究和应用。本研究主要基于嗜酸乳杆菌SPIDR 序列，结合ddPCR 方法定量检测饮料中的嗜酸乳杆菌，为该类产品的品质检测提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究根据国家卫生健康委员会发布的《可用于食品的菌种名单》，结合市场上饮料中常见的乳酸菌菌株，选择4 个嗜酸乳杆菌，19 个其他菌株进行特异性检测（表1）。

上述菌株购买后均由上海市质量监督检验技术研究院自行保存。 Lactobacillus acidophilus NCFM（HOWARU®Dophilus）、Lactobacillus acidophilus La-14、HN001 HOWARU®Rhamnosus、Lactobacillus casei Lc-11、Lactobacillus paracasei Lpc-115、Lactobacillus paracasei Lpc-37、Lactobacillus salivarius Ls-33 由丹尼斯克（中国）投资有限公司惠赠。

1.2 仪器与设备

T100 微滴式数字 PCR 扩增仪、QX200 微滴读取仪、PX1 板封口机、QX200 微滴生成仪，美国BIO-RAD；Vortex Genie2 漩涡振荡器，美国 SI；移液枪，美国GILSON；SW-CJ-2D 超净工作台，苏州净化；ESCO LA2-4A1生物安全柜，新加坡艺思高。

1.3 主要试剂与材料

ddPCR Supermix for probes、微滴生成专用油、96孔板、微滴生成卡，美国BIO-RAD。

引物与探针见表2，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

2 实 验

2.1 核酸提取方法

2.1.1 标准菌株核酸提取方法

表1 菌株名称及其编号

表2 本研究用到的引物与探针

（1）菌株富集：吸取1 mL 培养液，加入2 mL 无菌离心管中，13 000 rpm，离心5 min，去除上清，重复上述步骤1次，即共吸取培养液2 mL取沉淀。

（2）菌株裂解：富集后的沉淀中加入400 μL 10 mg/mL溶菌酶，37 ℃，水浴 2 h；加入 400 μL CTAB 裂解液，3 0 μL 蛋白酶K，混匀，56 ℃，2 h。而后进行核酸提取[22]。

2.1.2 实验样品核酸提取方法

样品进行前处理：取饮料25 mL 加入到225 mL 的无菌蒸馏水中，混匀，取5 mL 的样品加入15 mL 离心管中，9 000 g 离心 5 min，去上清；沉淀中加入 5 mL 无菌蒸馏水，涡旋振荡混匀，混匀液放在沸水中加热，直至蛋白质絮状物出现，9 000 g 离心5 min，去上清，沉淀中加入5 mL 无菌蒸馏水溶解，涡旋振荡器上混匀，再次在沸水中加热10 min，9 000 g 离心10 min，去上清。沉淀加400 μL 浓度为10 mg/mL 的溶菌酶，在涡旋振荡器上将沉淀混匀，37 ℃孵育2 h，加入400 μL的CTAB 裂解液，56 ℃水浴 2 h。而后提取核酸[22]。粗提取核酸进行过柱纯化，用于后续PCR 扩增。

2.2 体系及条件

ddPCR 扩增体系如下配制：2×ddPCR Master Mix 各 10 μL，NCFM P F（10 μmol/L）、NCFM P R（10 μmol/L）各 1.8 μL，NCFM P 探针（10 μmol/L）0.5 μL，DNA 模板 4 μL，无菌蒸馏水补足至 20 μL。配制好的反应体系移至微滴生成卡中，加70 μL 微滴生成专用油，在微滴生成器中将微滴生成卡中的样品生成微滴。取40 μL 生成的样品微滴至96 孔板中，封膜。在PCR 仪中进行扩增。扩增程序为：预变性10 min，96 ℃ ；94 ℃ 30s 变性，60 ℃ 1 min 退火加延伸，40 个循环；98 ℃ 10 min 热失活；4 ℃ 保存。升温速度2 ℃/s。扩增结束，将96 孔板放置在微滴读取仪中读数。

2.3 ddPCR 扩增方法建立

2.3.1扩增条件优化

2.3.1.1 扩增温度优化

以嗜酸乳杆菌标准菌株核酸为模板，优化扩增温度。退火温度设置为 60、59.2、58、56.1、53.8、51.9、50.7、50.0 ℃共8个温度梯度。

2.3.1.2 扩增模板优化

以嗜酸乳杆菌标准菌株核酸为模板，分别对10 ng/μL、5 ng/μL、3 ng/μL、2 ng/μL、1 ng/μL、200 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL 等几个核酸浓度进行检测。根据扩增显示的阳性微滴数选择最适的模板浓度。

2.4 ddPCR 扩增方法验证

2.4.1 特异性检测

特异性测试采用4 株嗜酸乳杆菌菌株，14 株其他乳杆菌，1 株嗜热链球菌以及4 株致病菌的核酸为模板，采用建立的ddPCR 扩增体系进行检测。

2.4.2 重复性试验

选取嗜酸乳杆菌标准菌株的核酸，选择1、0.1、0.01、0.001 ng/μL 等 4 个质量浓度的核酸稀释液进行扩增。根据阳性微滴数计算CV 值。

2.4.3 灵敏度试验

以嗜酸乳杆菌标准菌株核酸为模板，对核酸浓度分别为 3 ng/μL、2 ng/μL、1 ng/μL、200 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.5 pg/μL、0.25 pg/μL、0.05 pg/μL 进行检测。根据ddPCR 扩增显示的阳性微滴数选择最适的核酸浓度。

2.4.4 抗干扰试验

本研究选择质量浓度为 2 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL 的嗜酸乳杆菌标准菌株核酸，分别 1∶1 添加 1 ng/μL 与 50 pg/μL 的德式保加利亚乳杆菌，进行PCR 扩增。对比实验组与对照组阳性微滴数之间的差异，判断该方法抗其他菌种干扰的能力。

2.5 实际样品检验

市场上购买含有嗜酸乳杆菌的饮料共11 份，不含嗜酸乳杆菌的饮料1 份。提取样品核酸进行扩增，根据阳性微滴数计算样品中嗜酸乳杆菌含量。

3 结 果

3.1 扩增温度和模板浓度的优化

对引物和探针的温度优化扩增结果显示，不同温度梯度对于检测的结果影响较小。60 ℃时阳性微滴较多，选择60 ℃作为扩增的退火温度。

扩增浓度优化的结果图如图1 所示，可以看出，核酸浓度为10 ng/μL、5 ng/μL、3 ng/μL 时，无阴性微滴出现，提示核酸浓度过高；核酸浓度为2 ng/μL、1 ng/μL、200 pg/μL 和100 pg/μL 时，阳性微滴与阴性微滴之间有明显的界限，但核酸浓度为2 ng/μL 时拖尾较为严重。后续实验选择1 ng/μL 的核酸浓度作为实验浓度。

图1 模板浓度优化结果

3.2 ddPCR 特异性检测

特异性检测结果如图2 所示，嗜酸乳杆菌扩增出现阳性微滴，其他菌株均未出现阳性微滴，说明引物及探针的特异性好，方法适用于嗜酸乳杆菌的特异性检测。

3.3 重复性试验

不同浓度核酸重复性检测结果如表3 所示，检测结果的CV 值在2.34%～6.1%之间，小于7%，在可接受范围内，证明该方法的重复性好。

图2 特异性检测结果

表3 ddPCR重复性验证

3.4 灵敏度检测

核酸水平灵敏度检测结果表4 所示，核酸浓度为3 ng/μL 时，阳性微滴与阴性微滴不能区分；核酸浓度在 2 ng/μL～0.25 pg/μL 之间阳性微滴与阴性微滴可明显区分，0.1 pg/μL 时无阳性微滴出现，说明在核酸水平ddPCR 的检测下限为0.25 pg/μL。

表4 添加不同浓度菌株扩增微滴数

3.5 抗干扰试验

抗干扰试验结果如图3 所示，两者的扩增结果与对照组比较，两者在数值上无明显差异，证明该方法具有良好的抗干扰能力。

3.6 实际样品检测

对市售的11 份样品进行数字PCR 定量检测，结果显示标签标示添加嗜酸乳杆菌的样品全部扩增出阳性微滴（表5）。除10 号样品外，样品中菌的含量为1.6×103～2.3×106copies/g，与标签信息基本相符。结果表明，本研究建立的数字PCR 检测方法可用于实际样品中嗜酸乳杆菌的定量检测。

4 总 结

图3 添加干扰菌扩增的结果图

随着社会和民众对健康的重视，益生菌在食品中的应用越来越广泛，其中嗜酸乳杆菌作为一类功效显著的益生菌，在饮料、发酵乳、婴幼儿配方乳粉中应用较多。因益生菌原料成本较高，且为生物活性物质，其添加种类和添加量需要特别关注。我国食品安全国家 标准要求饮料中添加菌种的活菌数必须≥106CFU/mL。但目前，对于饮料中益生菌的菌种检测主要依赖传统的培养法，耗时耗力，结果受影响因素较多，难以满足市场精确鉴定和定量的要求，急需快速、准确、特异性高的检测方法。

目前，基于微滴式数字PCR 的分子检测方法在食品微生物检测中得到较大的关注和探索。蔡一村[23-25]等借助数字PCR 检测肉制品中掺假，并得出肉质量与阳性微滴数之间的关系式；赵新等[26-29]借助数字PCR 检测食品中的致病菌；Collier R 等[30]研究了数字PCR 在转基因植物检测方面的应用[31-32]；周巍[33-34]等开发了数字PCR 在乳制品中致病菌检测方面的方法。这些研究表明数字PCR 具有快速、准确、通量高等优点，是食品微生物定量的重要技术。目前，国内外对嗜酸乳杆菌的精确定量检测研究报道较少。

本研究利用菌种特异性引物建立了嗜酸乳杆菌数字PCR 检测方法并在饮料中应用。方法特异性高，灵敏度达到0.25 pg/μL，且重复性好。实际样品检验结果表明方法定性定量准确，与标签宣称基本相符。该方法可用于饮料中嗜酸乳杆菌的定量检测。