葡萄糖氧化酶和嗜酸乳杆菌与小檗碱配伍对大肠杆菌生长的抑制作用

陈景岩 耿启泉 常娟 王平 尹清强 刘超齐 李茂龙 朱群 卢富山

摘要 为了获得抗生素的最佳替代品，采用单因素和多因素设计开展了葡萄糖氧化酶（GOD）和嗜酸乳杆菌与小檗碱（BBR）配伍对大肠杆菌生长抑制作用的研究。单因素试验结果表明，葡萄糖氧化酶、嗜酸乳杆菌、小檗碱和金霉素均对大肠杆菌生长有显著的抑制作用 （P<0.05），并且随着浓度的增加其抑制作用逐步增强。多因素试验结果表明，选取 0.005 0%GOD和1×105 CFU/mL嗜酸乳杆菌与 0.001 5%BBR组合对大肠杆菌的抑制作用与75～150 mg/kg金霉素的抑菌作用相当。通过该研究获得了一种新的抗生素替代品，为畜产品安全生产提供了保障。

关键词 葡萄糖氧化酶;嗜酸乳杆菌;小檗碱;金霉素;抑菌作用

中图分类号 S816.7  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）20-0095-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.026

Inhibition Effects of Glucose Oxidase and Lactobacillus acidophilus and Berberine on the Proliferation of Escherichia coli

CHEN Jing-yan1，GENG Qi-quan2，CHANG Juan1 et al （1.College of Animal Science & Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450046;2.Weihui Agricultural and Rural Bureau of Henan Province，Weihui，Henan 453100）

Abstract In order to obtain the optimal substitute of antibiotics，the inhibition effects of combination of glucose oxidase （GOD） and Lactobacillus acidophilus with berberine （BBR）  on the growth of Escherichia coli were studied by single-factor and multi-factor experiments.The results of single-factor experiment showed that GOD，L.acidophilus，BBR and aureomycin individually had significant inhibitory effects on the proliferation of E.coli （P<0.05）， and the antibacterial activity gradually increased with increasing of their concentrations.The multi-factor experiments showed that the combination of 0.005 0% GOD，1×105 CFU/mL L.acidophilus and 0.001 5% BBR had the same inhibitory effect on E.coli growth with 75-150 mg/kg aureomycin.A new antibiotic substitute was obtained，which provided guarantee for the safe production of livestock products.

Key words Glucose oxidase;Lactobacillus acidophilus;Berberine;Aureomycin;Antibacterial activity

20世纪50年代我国就开始使用抗生素类饲料添加剂来提高动物的生产性能，但抗生素产生的滥用会导致动物肠胃功能紊乱，并产生抗药、耐药、二重感染以及体内残留等问题，给畜禽生产带来了巨大的威胁。因而，寻找可代替抗生素类的饲料添加剂势在必行 [1]。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是一种能在动物肠道内定殖的益生菌，其耐酸性和抗逆性强，是肠道内重要的益生菌。嗜酸乳杆菌具有调节机体肠道菌群平衡、抑制肠道病原微生物生长、提高机体免疫力等作用，已經被广泛应用于畜禽生产中 [2-4]。

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一种需氧脱氢酶，能专一氧化β-D-葡萄糖为葡萄糖酸和过氧化氢，并在此过程中消耗O2。目前，葡萄糖氧化酶已被广泛应用于食品、医药等领域。据报道，葡萄糖氧化酶具有抑菌、促进动物生长作用，且无毒、无抗药性，是一种替代抗生素的新型添加剂，具有广阔的应用前景 [5]。

小檗碱（berberine，BBR）是从黄连根茎中提取的异喹林生物碱，是我国传统中药之一。小檗碱具有显著的抑菌作用，临床上主要作为非处方药，用于治疗胃肠道炎症和细菌性痢疾 [6]。由于单一因素的抑菌作用所需剂量大、效果差、成本高，所以研究低浓度嗜酸乳杆菌和葡萄糖氧化酶与小檗碱配伍对大肠杆菌（Escherichia coli）生长的抑制作用，对于抗生素替代品的研制具有重要意义。笔者采用单因素和多因素设计开展了葡萄糖氧化酶（GOD）和嗜酸乳杆菌与小檗碱（BBR）配伍对大肠杆菌生长抑制作用的研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用大肠杆菌和嗜酸乳杆菌均由河南农业大学生物技术与动物营养研究实验室保存。小檗碱（纯度99%）和葡萄糖氧化酶（10 000 U/g）由河南德邻生物制品有限公司提供，盐酸金霉素（纯度90%）由福建浦城正大生化有限公司提供。

1.2 培养基 ①LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH为7.0～7.2，在121 ℃、0.15 MPa条件下高压灭菌20 min，4 ℃下保存备用。②MRS培养基：胰蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，吐温80  1 mL，磷酸氢二钾 2 g，无水乙酸钠5 g，柠檬酸铵2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH为6.2～6.6，在 121 ℃、0.15 MPa条件下高压灭菌20 min，4 ℃下保存备用。③伊红美蓝培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司）：称取42.5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH为（7.2±0.2），在121 ℃、0.15 MPa条件下高压灭菌20 min，备用。

1.3 菌种活化、计数与母液配制

将大肠杆菌接种到LB培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h后按照2% 接种量接入新鲜的LB培养基中，再于37 ℃、180 r/min摇床培养24 h后测定活菌数，置于4 ℃冰箱中保存备用。将嗜酸乳杆菌接种到MRS培养基中，37 ℃恒温培养箱中静止培养24 h后按照2%的接种量接入新鲜MRS培养基中，37 ℃恒温培养箱中静止培养24 h后测定活菌数，4 ℃下保存备用。分别将BBR、GOD、金霉素配制成0.03%、2.50%、0.15%的母液，用滤膜过滤除菌后4 ℃下保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1 不同浓度GOD对大肠杆菌生长的抑制作用。利用已配制好的GOD母液，分别配制成GOD终浓度为0、 0.005 0%、0.012 5%、0.025 0%的 LB培养液100 mL，按照1%的接种量接入大肠杆菌，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，分别在8、16、24 h对培养液进行取样，每组每个时间点9个重复。用伊红美蓝培养基计算大肠杆菌数量（CFU/mL），用常用对数表示。

1.4.2 不同活菌数嗜酸乳杆菌对大肠杆菌生长的抑制作用。将已经计数好的嗜酸乳杆菌分别稀释成最终活菌数为0、1×105、 1×106、1×107 CFU/mL的MRS培养液，将大肠杆菌按照1%的接种量接入含有不同活菌数嗜酸乳杆菌的100 mL MRS培养液中， 37 ℃、60 r/min摇床培养24 h，其他处理同“1.4.1”。

1.4.3 不同浓度BBR对大肠杆菌生长的抑制作用。将预先配制好的小檗碱母液配制成终浓度为0、0.001 5%、 0.003 0%、0.006 0%、0.009 0%的MRS 培养液100 mL，在 121 ℃、 0.15 MPa条件下高压灭菌20 min后，按照1%接种量接入大肠杆菌菌液，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，其他处理同“1.4.1”。

1.4.4 GOD与嗜酸乳杆菌组合对大肠杆菌生长的抑制作用。分别配制含0.005 0%GOD的不同活菌数嗜酸乳杆菌（0、1×105、1×106、1×107 CFU/mL）的100 mL MRS培养液，按照1%的接种量接入大肠杆菌， 37 ℃、摇床中60 r/min培养24 h，其他处理同“1.4.1”。

1.4.5 GOD、BBR和嗜酸乳杆菌组合对大肠杆菌生长的抑制作用。分别配制含有0.005 0%GOD和0.001 5%小檗碱及不同活菌数嗜酸乳杆菌（0、1×105、1×106、1×107 CFU/mL）的MRS培养液100 mL，按照1%的接種量接入大肠杆菌，  37 ℃、 60 r/min 摇床培养24 h，其他处理同“1.4.1”。

1.4.6 GOD和BBR与嗜酸乳杆菌的不同组合以及不同浓度的金霉素对大肠杆菌生长的抑制作用。配制含0.005 0%GOD、0.001 5%BBR和1×105 CFU/ml嗜酸乳杆菌的MRS培养液100 mL，配制金霉素有效含量分别为37.50、75.00、 150.00 mg/kg的MRS培养液100 mL，分别按照1%的接种量接入大肠杆菌，并以100 mL MRS培养液接入1%大肠杆菌作为对照组，在37 ℃、转速60 r/min的条件下摇床培养24 h，其他处理同“1.4.1”。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 17.0统计软件对所有数据进行处理，采用方差分析进行显著性检验，结果均以“平均数±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度GOD对大肠杆菌生长的抑制作用

由表1可知，仅添加2%葡萄糖对大肠杆菌生长有一定的抑制作用（P<0.05）。在仅添加单一GOD时，对大肠杆菌生长不具有抑制作用（P>0.05），而只能在有葡萄糖共同作用下才有抑制大肠杆菌生长的作用（P<0.05），且随着GOD浓度的增加和作用时间的延长对大肠杆菌生长的抑制作用逐渐增强 （P<0.05）。

2.4 GOD与不同活菌数嗜酸乳杆菌组合对大肠杆菌生长的抑制作用

由表4可知，0.005 0%GOD与不同活菌数的嗜酸乳杆菌组合对大肠杆菌具有显著的抑制作用（P<0.05），并且随着嗜酸乳杆菌活菌数的增加和作用时间的延长，抑制大肠杆菌的作用逐渐增强（P<0.05）。这初步证实了低浓度GOD 与不同活菌数嗜酸乳杆菌组合的抑菌效果与高浓度GOD相当，并具有较好的协同抑菌作用。

2.5 GOD和BBR与不同活菌数的嗜酸乳杆菌组合对大肠杆菌生长的抑制作用

从表5可以看出，0.005 0%GOD和0001 5%BBR与不同活菌数嗜酸乳杆菌组合具有明显抑制大肠杆菌生长的作用（P<0.05）。与单一因素或双因素组合结果相比，低浓度的三因素组合的抑菌作用更强。

2.6 GOD和BBR与嗜酸乳杆菌的不同组合以及不同浓度金霉素对大肠杆菌生长的抑制作用

由表6可知，低浓度GOD、BBR与嗜酸乳杆菌两两组合或者三者组合以及不同浓度的金霉素对大肠杆菌均具有明显的抑制作用 （P<0.05）。其中，三因素组合的抑菌作用最强，与150.00 mg/kg金霉素的抑菌效果相当。另外，GOD与嗜酸乳杆菌双因素组合的抑菌作用效果，与75.00 mg/kg金霉素的抑菌效果相当。

3 讨论与结论

3.1 单一BBR、GOD和嗜酸乳杆菌的抑菌功能

小檗碱具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化、抗痢疾等药理作用 [7]，通过建立人工感染沙门氏菌小鼠体内模型发现小檗碱可以抑制小鼠体内革兰氏阴性菌，并可延长细菌感染小鼠的存活时间及降低细菌感染小鼠的死亡率 [8]。借助人工建立大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌悬浮液体外模型，结果表明小檗碱具有抑制大腸杆菌（抑菌率93.96%）、金黄色葡萄球菌（抑菌率41.88%）、白色念珠菌（抑菌率34.28%）的作用 [9]，这与该研究结果相吻合。小檗碱的抑菌机理包括抑制菌体分裂、核酸复制、致病性和蛋白酶活性，与肠道菌群相互作用，并对胃肠道黏膜具有保护作用等 [7]。

葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一性氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。由于氧气的消耗抑制了需氧菌的生长，有利于厌氧益生菌的生长，形成微生态竞争优势，从而抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的存活，所产生的过氧化氢具有杀菌作用 [10]。该研究结果表明，GOD能够显著改善动物肠道微生态平衡以及肠道消化环境，保护肠道健康，提高饲料的利用率，促进动物的生长和增强动物机体抗病力，是一种绿色、安全、高效、对人体无毒副作用的饲料添加剂 [11]。杨久仙等 [12]研究表明日粮中添加0.2%和0.3%GOD可以显著降低仔猪胃和回肠的大肠杆菌数量，增加仔猪胃和回肠内乳酸菌数量。汤海鸥等 [13]开展了GOD体外抑菌试验，结果表明GOD对大肠杆菌和沙门氏菌生长具有明显的抑制效果。该研究结果表明，低剂量的GOD也表现出较好的抑制大肠杆菌生长的作用。

嗜酸乳杆菌是一种微生态制剂，属于乳酸菌家族的成员，可在肠道中定殖，具有改善和调节肠道微生物菌群平衡、抑制病原微生物生长、增强机体免疫力及抑制肿瘤细胞的形成等功能 [14-15]。Sartor [2]报道用嗜酸乳杆菌对137例急性腹泻患者进行治疗，结果表明口服嗜酸乳杆菌制剂24 h后，82%的患者腹泻次数明显减少，粪便稠度也有改善;治疗 72 h 后，所有患者排便次数和粪便稠度恢复正常。该研究结果表明，单一的嗜酸乳杆菌具有较强的抑制大肠杆菌生长的作用，且随着嗜酸乳杆菌数量的增多，其抑菌效果逐渐增强，是一种较好的抗生素替代品。

3.2 GOD、BBR与嗜酸乳杆菌组合对大肠杆菌的抑制作 用

虽然单一GOD、BBR和嗜酸乳杆菌都具有良好的抑制大肠杆菌生长作用，但使用剂量均较高，这在生产成本和实际应用中都受到一定的限制。另外，GOD、BBR和嗜酸乳杆菌这3种产品均有各自的优势。如何发挥三者的协同作用，对于研制高效的抗生素替代品具有重要意义。

GOD可以催化葡萄糖生成葡萄糖酸，改善胃肠道酸性消化环境，当与嗜酸乳杆菌配合可在肠道内发挥酸化剂和微生态制剂的双重作用，可使胃肠道内pH降低，抑制大肠杆菌的生长和繁殖，促进益生菌的增殖 [16]。赵国先等 [17]研究表明，在日粮中添加 GOD能不同程度降低回肠和空肠pH，但对胃和十二指肠中pH却无显著影响;同时，GOD 还具有明显抑制大肠杆菌生长、促进盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌增殖的作用。嗜酸乳杆菌属于肠道中乳杆菌属，同时也是肠道中的益生菌类，产酸能力强，与GOD配伍可以起到协同抑制大肠杆菌的作用。

Wang 等 [18]报道BBR通过减少肠道菌产生ATP和NADH，起到抑菌作用。Zhang 等 [19]报道小檗碱能够增加具有短链脂肪酸产生功能的 Blautia 和 Allobaculum 等菌属数量，调节肠道pH，抑制大肠杆菌的生长和繁殖。据报道，益生菌和中药提取物配伍使用通常比二者单一使用具有更强的抗菌作用 [20-21]，充分证实了BBR与益生菌协同抑制大肠杆菌生长的有效性，与该研究结果相一致。

GOD与益生菌配伍以及益生菌与BBR配伍的协同抑菌作用已有相关报道，但GOD、嗜酸乳杆菌、BBR三者协同对大肠杆菌生长的抑制作用尚未见报道。该研究结果表明，低浓度葡萄糖氧化酶和低浓度嗜酸乳杆菌与低浓度小檗碱配伍，其抑菌作用与75～150 mg/kg金霉素相当，充分证实了三者配伍对抑制大肠杆菌生长和繁殖的有效性和叠加性，为抗生素替代及畜产品安全生产提供了一种新的饲料添加剂。

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