土壤中抗生素检测技术研究进展

刘爽 朱海荣 于燕萍 齐云 苏本玉 于晓菲 商姗姗 张娟

摘要 土壤中抗生素残留问题受到越来越广泛的关注，抗生素含量测定的检测技术研究亦越来越受到重视。目前国内外开发了多种土壤中抗生素检测的方法，主要包括免疫分析法及理化分析方法，其中理化分析方法最为常用。就土壤中抗生素常用的检测方法进行归纳总结，汇总了近年来国内外主要检测方法的研究对象、检出限、回收率，探讨了现有方法的优缺点及存在的主要问题，并对今后土壤中抗生素的检测技术进行了阐述与展望。

关键词 土壤;抗生素;检测技术;优缺点;存在问题

中图分类号 X833  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）20-0009-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.003

Research Progress of Antibiotic Detection Technology in Soil

LIU Shuang，ZHU Hairong，YU Yanping et al （Shandong Institute of Product Quality Inspection，Jinan，Shandong 250100）

Abstract More and more attention has been paid to the problem of antibiotic residue in soil，and more and more attention has been paid to the detection technology of antibiotic content.At present，many methods for the detection of antibiotics in soil have been developed at home and abroad，including immunoassay and physicochemical analysis，among which the most commonly used methods are physicochemical analysis.This paper summarized the common detection methods，summarized the research object，detection limit and recovery rate of the main detection methods at home and abroad in recent years，discussed the advantages and disadvantages of the existing methods and the main problems existing，and expounded and prospected the detection technology of antibiotics in soil in the future.

Key words Soil;Antibiotics;Detection technology;Advantages and disadvantages;Existing problem

抗生素作為一类抗菌性药物广泛用于预防和治疗人类、动物疾病，并且在畜牧和水产养殖业中用于促进动物的生长 [1]。有研究表明，环境介质中抗生素含量与人口密度呈正相关 [2]，而且进入人或动物体内的抗生素有60%～90%以原药及代谢产物的形式通过粪尿排出体外，进入环境中 [3]。抗生素残留进入土壤环境后

经过一系列物理化学过程可被某些植物吸收富集 [4]。已有文献证明，某些农作物可吸收累积抗生素，如Liu等 [5]研究了多种抗生素对水稻、黄瓜和莜麦的生长抑制作用，发现四环素类（TCs）和磺胺类（SAs）能够显著抑制农作物的发芽率;Chung等 [6]研究发现四环素、 恩诺沙星和磺胺噻唑可以被萝卜的根和叶从土壤中吸收，从而延缓了萝卜的生长。大量的抗生素及其生物活性代谢产物或降解产物通过施肥和灌溉引入土壤。抗生素的环境污染已变得越来越严重，给农业生态系统带来了巨大的风险 [7]。

因此，对土壤中抗生素残留的检测非常重要，有必要对目前土壤中抗生素检测技术研究进展情况进行总结分析，阐明现阶段的常用检测技术，为其风险评价奠定基础。笔者对土壤中抗生素检测方法进行对比分析，并对现使用的检测方法进行总结分析，以期促进土壤中抗生素检测方法的进一步开发与应用。

1 土壤中抗生素的来源及种类

1.1 来源

自然界中的动植物、微生物在其活动过程中也能够分泌极其少量的抗生素，但并不足以对生态环境产生影响 [8]。农业土壤中抗生素的潜在来源是废水灌溉和施肥 [9]。废水中抗生素的来源包括生活污水、医院和药厂废水、畜禽和水产养殖业废水等 [10]。施肥引入的抗生素来源包括粪肥、城市污泥堆肥和商品有机肥。畜禽粪肥或其堆制的有机肥中普遍含有抗生素 [11];城市污泥的处理方式之一就是经堆肥后作为有机肥农用 [12]，城市污泥中亦存在抗生素残留的现象;商品有机肥的应用也会增加土壤中抗生素 残留 [13]。

1.2 主要种类

目前存在的天然抗生素和合成抗生素有上万种 [14]，主要分为磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、林可酰胺类及糖肽类等多个种类 [15]。在土壤中研究较广泛的有磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素5类。其中，磺胺类抗生素具有效价高、毒性小、抗菌谱广、使用简便等优点 [16]，是养殖业中常用兽药之一;四环素类抗生素抗菌范围广泛，且价格便宜，成为养殖业使用量最多的抗生素种类，随尿液、粪便排出体外，然后以粪肥形式施入土壤。因此，磺胺类和四环素类抗生素成为土壤中检出率较高的抗生素种类。

2 土壤中抗生素残留检测技术

国内外对环境介质中抗生素的检测方法主要包括微生物检测法、免疫分析法和理化分析法 [17];理化分析方法主要包括薄层色谱法、毛细管电泳法、液相色谱法和液质联用法 [18]。根据国内外近几年的相关研究报道，微生物检测法被广泛用于牛乳抗生素检测，其主要原理是在样品中加入一定量抗生素，利用抗生素对特异微生物生理机能和繁殖代谢的抑制作用对样品中抗生素定性定量 [17]，在土壤中抗生素的应用鲜见报道。土壤中抗生素的检测方法主要有免疫分析法、毛细管电泳法、液相色谱法和液质联用法，其中应用最广泛的为液质联用法。

2.1 免疫分析法

免疫分析法且具有快速、简单和直观等特点 [14]，且具有可现场检测的优势。但该方法通常存在精确性和重现性较差的问题，主要用于农产品及食品中的快速筛查 [18]，应用于土壤中抗生素检测的报道较少。

韦薇 [19]基于碳纳米管免疫新方法，建立了庆大霉素抑制曲线，可用于检测水、土壤等介质中庆大霉素的检测，检测限（IC 90）为  0.048 ng/mL，线性范围（IC 80～IC 20）为0.080～0.512 ng/mL，回收率为 74.3%～126.8%，RSD<13.2%。相对于常用的理化方法来说，该方法的样品处理过程简单，但该类方法开发周期较长。

2.2 理化分析法

目前，理化检测法广泛用于环境中抗生素痕量检测 [17]。理化检测法具有灵敏度高、检测限低、重现性好等优点，但其前期处理步骤繁杂 [14]。现阶段使用的毛细管电泳法、液相色谱法和液质联用法，在进行检测前样品必须经过预处理过程，将目标物提取、纯化后进行检测。

2.2.1 樣品前处理。

常用的样品前处理方法包括索氏提取（SE）、机械振荡法（MSE）、超声提取（UAE）、加速溶剂萃取（ASE）、微波辅助萃取（MAE）、超临界萃取（SFE）、QuEChERS、固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）等方法。通过对近年土壤中抗生素常用检测方法所使用的前处理方法汇总分析，发现SE、SFE和SPME方法鲜见报道，其他方法有所应用 [20-57]。为提高检测效果、减少杂质干扰，通常会将其中2种或多种联用进行样品前处理。

机械振荡法（MSE）主要是将土壤样品与溶剂混合后，采用振荡仪连续长时间振荡，使溶剂与土壤样品内部充分混合，进而提取其中的有机物残留成分 [58]。该方法耗时长、提取效率低。如刘虹等 [20]对水、沉积物及土壤中氯霉素和3种四环素类抗生素的研究中使用了该方法，其方法回收率 较低。

超声提取（UAE）是一种比较常用的固液萃取技术，其主要是通过产生快速机械振动波来削弱提取物与土壤基质之间的作用力，从而实现提取物与土壤分离 [58]。该方法是目前国内外最常用的提取方式之一，常与固相萃取法联合 使用。

加速溶剂萃取（ASE）也叫加压液相萃取（PLE），该方法适用于提取固体，特别是干燥的、含有小颗粒的固体样品中的有机物，它利用高温高压增加物质的溶解度和扩散效率，达到加速提取的目的 [58]。在开发该方法时，必须优化几个参数，如温度、压力、静态时间、循环数以及萃取溶剂的性质，其中溶剂是最影响萃取效率的参数 [59]。该方法对环境样品和食品中的多氯联苯、多环芳烃、有机磷/氯、农药和除草剂等的萃取已经非常成熟 [21]，不适合遇热不稳定化合物，且技术设备昂贵，目前国内在土壤抗生素的检测中应用正在开展，国外应用相对较多。国内马珊珊等 [31]等建立了加速溶剂萃取-固相萃取的前处理方法对土壤中青霉素及逆行检测，其方法回收率为73.1%～89.7%;国外Salvia等 [22]建立了改良的加速溶剂萃取- QuEChERS的前处理检测土壤中磺胺嘧啶、磺胺噻唑等9种抗生素，提高了部分抗生素如磺胺嘧啶、磺胺噻唑等磺胺类的回收率，回收率在73%～102%，均取得了良好的检测效果。

微波辅助萃取（MAE）是通过内加热由内向外均匀地、迅速地将样品进行加热，可在极短的时间内将样品与溶剂升高至很高的温度，从而加快萃取效率，实现样品与化合物的快速分离 [15]。但该方法用于热不稳定性化合物可能会导致其分解，目前国内对该方法在土壤抗生素检测技术中的应用较少，国外使用较多。ukaszewicz等 [48]使用微波辅助萃取-固相萃取前处理方式，电喷雾电离源（ESI）-三重四极杆质谱仪检测了四环素、土霉素、金霉素的含量，回收率在73.3%～128.0%，对抗生素具有良好的提取效果。

QuEChERS 是Quick、Easy、Cheap、Efective、Rugged、Safe 的缩写，即快速、简单、经济、高效、稳定、安全，是由美国的 Anastassiades 等 [60]开发的一种最初应用于果蔬中农药残留的前处理方法。该方法步骤可以简单归纳为：乙腈提取;加入盐类分层;加入无水硫酸镁除水，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基建和硅胶（C 18）、石墨化碳黑（GCB）等吸附剂净化除杂;取上清液进行检测 [15]。目前，该方法在农药残留中应用较广泛，在土壤中抗生素的检测逐步开展。Chung等 [47]利用QuEChERS方法检测了土壤中四环素、恩诺沙星和磺胺噻唑，回收率在77.1%～114.8%，该方法快速有效。

固相萃取（SPE）是一种基于液相色谱理论，利用选择性吸附和洗脱进行物质分离，是样品前处理中应用最广泛的一种净化方式。目前，该方法与超声萃取相结合的前处理方式即超声萃取-固相萃取的前处理方法在国内土壤中抗生素检测中应用最为广泛。范菲菲等 [29]使用超声萃取-固相萃取的前处理方法检测了土壤中土霉素的含量，回收率在 70.5%～128.8%，能够满足检测需求。

固相微萃取（SPME）是一种集采样、萃取、富集、进样于一体，以达到快速、便捷、成本低以及样品量少的目的的前处理技术 [61]。目前该技术发展迅速，在水体中抗生素的检测中已有应用，但在土壤抗生素的研究鲜见报道。

目前国内外最常用的前处理方法为超声萃取-固相萃取联合使用的技术，加速溶剂萃取-固相萃取、微波辅助萃取-固相萃取及QuEChERS前处理方法的应用次之 [20-57]。以上方法的单独使用或联合使用并不能分离出样品中的阳离子物质，由于土壤中存在大量共萃取的天然有机物和多价阳离子，在用质谱进行检测时，会对四环素类抗生素产生影响 [23]，目前有报道采用强阴离子交换柱与固相萃取柱串联的方式进行纯化 [22]，可以减少质谱检测中的基质效应，如Hu等 [24]开发的土壤中氟喹诺酮类、四环素类和磺酰胺类抗生素检测方法中使用强阴离子交换柱，可以吸收土壤提取物中的阴离子腐殖质颗粒，从而减少了基质干扰。

2.2.2 检测方法。

2.2.2.1 毛细管电泳法。毛细管电泳法是近年来发展比较迅速的一种分析方法。毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度（单位场强下离子的迁移速率）和分配行为上的差异而实现组分分离的技术，毛细管电泳使用毛细管柱，在pH>3的情况下，其内表面带负电，与溶液形成双电层，在高电压作用下，根据正负离子和中性粒子的迁移速度不同、流出毛细管柱的时间不同从而实现分离 [62]。

左艳丽 [21]通过加速溶剂萃取（ASE）-毛细管电泳检测（配有二极管阵列检测器）土壤和底泥中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺间二甲氧基嘧啶3种磺胺类药物残留的方法，结果发现，其线性范围为0.6～100.0 μg/mL，定量限（LOQ， S/N=10）为0.056～0.070 mg/kg，平均回收率在 82%～103%，RSD≤4.3%。李兴华等 [25]采用固相萃取（SPE）纯化、富集，高效毛细管电泳（HPCE）（配有紫外光谱检测）同时测定土壤样品中13种抗生素的含量，结果发现，其线性范围均在 150 μg/L 以内，检出限（S/N=3）在0.40～1.0 μg/L，回收率在 78.5%～107.0%。使用该方法检测出养殖场土壤样品中的磺胺嘧啶和磺胺噻唑。

毛细管电泳法在医药领域应用较为广泛，近年来在环境介质中抗生素的检测应用开始有所报道。该方法具有操作简单、分离效率高、分析速度快、操作模式多、试验成本低等优点 [25]，但在超低流量情况下灵敏度不高，因此常与紫外检测器、荧光检测器、质谱仪联用，以提高该方法在低流量情况下的灵敏度，降低检测限 [14]。

2.2.2.2 液相色谱法。

液相色谱法在有机化学、环境监测、生物、食品、医学等领域广泛应用。抗生素检测方法中液相色谱法常以C 18或相似的反相色谱柱为固定相，以甲醇、乙腈、水、甲酸溶液、乙酸铵溶液等溶剂为流动相，将多种抗生素进行分离。该方法是抗生素残留分析的一种重要检测手段，其检测器类型包括紫外检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、示差检测器和蒸发光检测器等。在土壤抗生素的检测方法中，常用检测器为紫外检测器 [20，27-30，32，34]、二极管阵列检测器 [31]和荧光检测器 [26，33]，其中国内常用的检测器为紫外检测器，国外常用的检测器为荧光检测器 [26，33]。从检出限来看，使用荧光检测器的检出限更低，如Speltini等 [26]研究的从土壤中检测恩诺沙星（ENR）和达诺沙星（DAN）及2种主要光转化产物（PTP）的方法中使用了荧光检测器，虽未报道详细检出限，但其线性范围为μg/L级（2～200 μg/L）;而杨晓蕾等 [27]研究的土壤中恩诺沙星等 10种兽用抗生素检测方法中使用了紫外检测器，其线性范围为mg/L级（0.1～ 10.0 mg/L），说明荧光检测器对喹诺酮类抗生素恩诺沙星的检测浓度更低。荧光检测器在检出限方面具有更大的优势。

2.2.2.3 液相色谱-质谱联用法。

目前，土壤中抗生素的检测技术主要为液相色谱-质谱联用法。液质联用結合了液相色谱对复杂基体化合物的较高分离能力以及质谱所具备的独特的选择性、灵敏度、相对分子量和结构信息于一体，现在广泛被应用于生物、食品、医药等行业 [63]。质谱仪中常用的离子源有电子轰击离子源（EI）、电喷雾电离源（ESI）、大气压化学电离源（APCI）等。EI 离子源属于硬电离技术，是气相色谱-质谱联用仪中常用的离子源;ESI 离子源与APCI离子源属于软电力技术，主要应用于液质联用，可用于分子量大、不易汽化和热稳定性差的样品分析 [64]。质谱仪中最核心最重要的部分是质量分析器。常见的分析器基本类型有四极杆、离子阱、飞行时间、磁偏转和离子回旋共振。

通过总结近年来国内外土壤中抗生素检测的液质联用方法研究成果，可见液质联用方法所使用的离子源有ESI、APCI，其中ESI为最常用离子源;质量分析器有单四极杆、离子阱和三重四极杆，其中三重四极杆最常用 [22-24，35-58]。

ESI与APCI这2种离子源是传统大气压离子化技术的代表 [65]。ESI 技术是一种突破了离子的生成只能依赖样品的气化质谱技术，可以使非挥发性和热不稳定性的化合物形成离子，既可以检测小分子化合物，也可以测定极性强、热稳定性差的生物大分子，如核酸、蛋白质、多肽等 [66]。大部分抗生素不易挥发，在其检测技术中常使用ESI的离子源 [22-24，35，37-58]。朱秀辉等 [57]采用电喷雾电离源（ESI）-三重四极杆质谱对土壤中四环素、土霉素和金霉素进行检测，结果发现回收率为70.43%～96.79%，检出限为0.03～ 0.13 μg/L。APCI的离子化效率接近 100%，不易形成多电荷分子碎片，质谱图相对简单，其主要用于易挥发、热稳定、低极性和半极性的小分子化合物的分析 [67]。该方法应用较少，Schlüsener等 [36]使用了APCI离子源-三重四极杆质谱对土壤中放线菌、头孢菌素等9种抗生素进行检测分析，结果发现回收率为43%～94%，检出限为0.2～1.6 mg/kg，相对于ESI离子源-三重四极杆质谱的检测方法，检出限高。

三重四极杆与单四极杆相比，其定性更准确、灵敏度和分辨率更高;与离子阱相比，选择性强、定量更准确。因此，在抗生素检测中多使用三重四极杆的质量分析器。近年来，有科研人员开发了四极杆和线性离子阱的联用质谱（ Q -trap），这种质谱既具有三重四极杆质谱的高选择性和高灵敏度，又具有离子阱强大的全扫描能力 [68]，但这种质谱在药物分析领域应用较为广泛，在土壤中抗生素的检测中鲜见 报道。

与液相色谱法、毛细管电泳法相比，液质联用方法具有定性更准确的优势。在定量方面，如表1中所示各典型检测方法的检出限，液质联用的检出限比使用紫外检测器的液相色谱法与毛细管电泳法的检出限低，与使用荧光检测器的液相色谱法检出限相当。

液质联用检测时易受到基质效应的影响，一方面，土壤样品的基质会极大地影响分析物信号或增强背景噪音，影响的程度与共提取组分的浓度和质子化水平有关 [69]，另一方面，由于土壤之间的特性差异很大，不同土壤样品的基质效应值是不同的 [37]。因此，在使用液质联用进行检测时，通常需要对基质效应进行评估，采用基质加标的方式进行检测。

目前，土壤中研究较多的抗生素种类包括磺胺类、喹诺酮类和四环素类 [20-57]，其中检出种类较多的是四环素类和磺胺类。有研究表明，四环素类抗生素检出率高 [53，70-71];土壤中磺胺类抗生素磺胺嘧啶（SDM）在土壤中具有很高的稳定性，不易降解 [35];土壤吸附的氟喹诺酮类本身易于光降解 [26]，土壤中喹诺酮类抗生素检出较少。

3 结论与展望

目前，土壤中抗生素的检测方法主要是采用超声萃取-固相萃取、加速溶剂萃取-固相萃取、微波辅助萃取-固相萃取或QuEChERS前处理技术，使用液相色谱或液质联用进行定量测定，尤其是液质联用法，是目前土壤中抗生素的重要检测技术。

土壤样品基质复杂，前处理工作繁琐，目前仍要为改善抗生素前处理技术开展更多的研究工作。近年来新兴的固相微萃取技术可逐步应用到土壤抗生素检测技术中，将萃取、富集等集于一体，提高前处理效率，保障方法的重复性。

近年来，毛细管电泳-质谱联用法、拉曼光谱法、免疫分析法发展迅速，也可应用到土壤抗生素的检测技术中。多种分析技术联用是分析化学的重要发展方向，可将不同技术优点进行集合、优化，缩短检测时间，提高检测灵敏度，如对于常用的液质联用技术，结合不同质量分析器的优势，将不同的质量分析器联用可以达到更佳的检测效果，建立同时检测抗生素的高通量筛选方法，达到多种抗生素同时检测的需求，为土壤中抗生素残留风险分析奠定基础。

抗生素环境污染问题事关人身安全，是重大的民生和公共安全问题。目前，国家环境保护部正在将抗生素污染纳入管控范围，以控制由此带来的环境风险。抗生素含量检测技术作为风险评价及防控的基础，将迎来更快、更准确且同时检测的快速发展进程。

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