蛋白原核表达技术在本科开放实验中的设计与实践

谢 鑫 陈美晴 王 勇 蒋君梅 任明见

（贵州大学农学院 贵州·贵阳 550025）

蛋白是生物体行使其物理、化学特性和功能的重要基础。大肠杆菌原核表达系统是开发最早、应用最广的蛋白质表达系统。它通过将克隆的目的基因插入原核表达载体，随后转化到大肠杆菌中，再通过诱导表达、纯化，获得目的蛋白。[1]原核表达技术具有遗传背景清楚、生长速度快周期短、蛋白表达水平高、抗污染能力强、可大规模培养、成本低、易操作、蛋白表达载体种类多、适用范围广等特点，是重组蛋白表达的理想系统，被广泛应用于重组蛋白表达。[2-4]但原核表达的效率易受到诱导菌株类型、诱导温度范围、诱导剂浓度等因素的影响。[5]随着遗传学、分子生物学和蛋白质组学的发展，对重组功能性蛋白质的市场需求急剧增加，首要条件就是要获得大量表达蛋白（高度纯化且折叠正确的蛋白质），[6]为实现蛋白质产品的商业化和其功能及相互作用进行系统分析。但获取大量高纯度蛋白质在蛋白质结构性研究和生物技术产品开发中经常会成为瓶颈现象，严重限制蛋白功能性的后续研究，所以蛋白质的表达技术是必不可少的。

近年来，原核表达技术被广泛应用于蛋白结构与功能分析、抗体生产、蛋白质相互作用等方面。[7]运用该技术可以提供足够的人工抗原，用于蛋白质的快速鉴定和结构分析。随着对基因功能学研究的不断深入，越来越多的实验室也在尝试用原核细胞表达蛋白。本次开放教学实验对原核表达技术在本科教学中进行探索，并对蛋白可溶性表达条件进行优化，以提高蛋白表达效率。

为了提高学生对原核表达技术的理解和掌握，更加直观清晰地了解原核表达技术，帮助他们深入了解相关的分子生物学和基因工程类实验的原理和操作程序。我们以高粱14-3-3 基因家族中的SbGF14c 基因为实验材料开展本次实验教学。预期本次教学经验可在校内及其它高校进行推广。

1 教学内容

本次开放课程的教学内容是“利用原核表达技术表达外源蛋白SbGF14c”。首先让同学查找该蛋白的相关信息，分析其氨基酸序列、物理化学特性、蛋白结构等，了解原核表达技术的步骤，在老师的帮助下学生自主设计实验；其次，在原核表达中，蛋白通常以包涵体的形式存在于沉淀中，如何让蛋白在细胞上清中以可溶性形式表达是原核表达中面临的技术难题。本次实验学生通过自己手动设计实验完成蛋白的原核表达，得到可溶性表达蛋白；最后，采用Western blot技术对重组蛋白的表达进行鉴定。通过本次实验可加深学生对原核表达方法的理解，同时锻炼了学生的动脑思考、独立设计、动手操作、分析结果和总结归纳的能力。本次实验的主要内容有目的基因的PCR扩增、重组载体构建、转化表达菌株、蛋白可溶性表达条件筛选及重组蛋白鉴定。

表1 教学内容安排

本次教学共分4 个小组，3 个人一组。教学内容安排如表1。

2 教学效果

在本次开放实验中，我们把目的基因的克隆、原核表达载体构建、大肠杆菌转化、蛋白可溶性表达以及蛋白检测作为一个完整的教学实验，让学生学习从目的基因的克隆到蛋白原核表达及检测完整流程。从实验结果可以看出，用12% SDSPAGE 电泳检测到目的蛋白的表达（不同菌株、温度、IPTG 浓度），以及用Western blot 进一步证实所表达的蛋白，让学生通过实际操作更加直观的看到实验结果，加强了对蛋白原核表达技术（背景、原理、步骤）的理解和掌握，同时在实验过程中也激发了学生对蛋白表达的学习兴趣，解决学生心中对蛋白原核表达的疑惑。因此，本次实验教学是本科生物类专业中一个非常值得推广的实验教学，具体体现在以下几个方面：

（1）增强学生对蛋白序列和原核表达技术的理解。本次教学实验，让学生参与实验设计，利用在线资源自主设计实验步骤并进行验证，在此过程中学生学会了使用网络数据库查询蛋白序列及蛋白性质的相关信息。在信息高速发展的今天，本课程结合生物信息学基础，使学生更加直观的了解基因和蛋白，这也是本实验教学改革的主要目标之一。

（2）通过实验操作锻炼学生的动手和分析能力。在实验过程中需控制菌液浓度OD600=0.5，使细菌处于最适外源蛋白表达状态，有的同学对菌液OD 值把握不准，需在实验中进行多次探索，积累经验；有的同学在做细菌转化实验时，没有转化子长出来，与小组成员及老师一起探讨失败原因或与实验成功的同学交流学习，总结教训；有的同学在做SDSPAGE 电泳转膜实验时，遇到没有条带，与大家共同商讨出错原因等等。这些问题的解决更加说明在本科阶段很有必要设立诸如这类动手能力强的实验课程，加强学生的实际操作能力。

（3）本次实验教学适合推广学习。本次实验教学属于分子生物学、生物化学范畴。对于只知理论未进行实际操作的同学具有实际意义。对于生物类专业的同学，学校具备相关的实验设备，更应该开设该课程。此外，对于不同的教学环境可以根据自身条件进行适当调整实验内容，希望原核表达实验的推广能够使更多的学生受益。

3 教学总结

（1）在本次开放实验教学中，将目的基因的克隆、构建原核表达载体、大肠杆菌转化、原核表达、Western blot 验证原核表达蛋白，作为较完整的原核表达的综合实验，有利于学生掌握和理解基因克隆、蛋白表达及检测的实验技术和原理。

（2）蛋白表达和Western blot 是目前生物学研究中应用最广泛的实验技术，通过实验教学使学生熟练掌握这些实验技术和各种实验仪器的使用，为将来从事科学研究打下坚实的基础。

（3）本次教学中，由于实验课时的限制，实验均在周末进行。为达到更好的教学效果，教学要求实验过程不仅要高效还要省时直观，让学生一目了然。此外，今后还需进一步增加多样化教学方式，充分调动学生的积极性，学生在实验中收获到成就感，兴趣和积极性便自然提高，这样教学效果、教学质量会更好。这些是我们今后进一步改进的方向。

（4）本次教学为课堂教学提供了基础，有利于学生在课堂教学后回顾本次实验教学，最终达到融会贯通。