芫花素对乙酰胆碱酯酶抑制作用研究

肖正凤

(陕西学前师范学院，陕西 西安 710062)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)被认为是最常见的一种痴呆形式，是一种进行性神经障碍，其特征是记忆力丧失和其他智力能力的严重损害[1]。关于AD发病机制的学说有不少，其中最为广泛接受的是“胆碱能假说”，该学说认为AD与乙酰胆碱(ACh)的降低水平和脑内胆碱能神经元的丢失有关[2]。因此，通过增加脑内乙酰胆碱水平、改善胆碱能系统的是治疗AD的重要方法。

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，一种能将神经递质ACh分解成乙酸和胆碱的酶，阻碍正常的神经传递，在调控胆碱能系统中发挥关键作用[3]。阿尔茨海默病的胆碱能假说指出，抑制AChE作用可能是治疗阿尔茨海默病症状重要方法之一。基于此，7-甲氧基他林(7-methoxytacrine)、多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)及石杉碱甲(huperzineA)等多个AChE抑制剂已被研制成功，并投入临床用于调节和控制AChE的活性及预防和治疗阿尔茨海默病，成为目前治疗阿尔茨海默病的主要药物[4]。但是目前已投入临床中的抑制剂对于改变重度阿尔茨海默病患者的症状效果不佳，同时存在选择性低、副作用较大等问题。因此，寻找能够有效抑制AChE活性、选择性好、副作用小的新型天然产物，并探讨它们的抑制作用及机理，对于研发治疗阿尔茨海默病的药物和了解AChE抑制剂发挥药效的作用机制具有重要意义。

芫花素(genkwanin)又叫芫花黄素，为淡黄色针状结晶，属于黄酮类化合物，其成分来源为瑞香科植物芫花。据我国药典记载，芫花具有解毒杀虫、泻水逐饮的功效；内治痰饮积聚、气逆喘咳、水肿胀满、胸腹积水、二便不利，外治疥癣秃疮、冻疮[8]。现代药理研究表明，芫花素具有多种药理活性，例如抗肿瘤、抗炎、镇咳祛痰、保护脑缺血神经损伤及心肌细胞缺血再灌注损伤、降血压、抗焦虑、抗菌、抗病毒以及抗氧化调节免疫功能等作用[9-11]。

本文发现芫花素对AChE的活性具有一定的抑制作用，探讨了芫花素与AChE的相互作用，并采用酶抑制动力学研究了其抑制机理，旨在于为建立芫花素与AChE结合的体外模型、揭示芫花素抑制体内生物学作用机制及利用、设计或开发新药等提供理论依据。

1 实 验

1.1 试剂和仪器

试剂：eeAChE(来源于电鳐)、碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)及联硫代双硝基苯甲酸(DTNB)，美国Sigma公司；芫花素，中国食品药品检定研究院；二甲基亚砜、磷酸二氢钾、乙醇、磷酸氢二钠均购自西安化学试剂厂。实验所用试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水。

仪器：PE Lambda35型紫外可见分光光度计，美国PerkinElmer公司；pH数显酸度计，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

用磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH为7.5的0.01 mol·L-1的PBS缓冲溶液。用pH为7.5的0.01 mol·L-1的PBS缓冲溶液配制浓度为1.17 mg/mL的AChE贮备液，冷冻储存，使用时用磷酸盐缓冲溶液稀释至所需浓度；用pH为7.5的0.01 mol·L-1的PBS缓冲溶液配制浓度为1.87×10-3mol·L-1的碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)贮备液，用时稀释至所需浓度；用pH为7.5的0.01 mol·L-1的PBS缓冲溶液配制浓度为1.25×10-3mol·L-1的联硫代双硝基苯甲酸(DTNB)储备液，用时稀释至所需浓度。用二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为1×10-2mol·L-1芫花素储备液。

1.2.2 芫花素对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用

按照Ellmann法[12]检测AChE的活性。在25 ℃下，pH=7.5，0.01 mol·L-1PBS中，以碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)为底物。酶促反应的产物硫代胆碱与联硫代双硝基苯甲酸(DTNB)发生反应，其产物为黄色化合物的5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)。TNB在412 nm处的摩尔消光系数ε为14150 L·mol-1·cm-1，用紫外分光光度计测定TNB在412 nm处的吸光值[13]。

未加抑制剂AChE活性的测定：在1 mL比色管中加入515.6 μL PBS缓冲溶液、8 μL的AChE使用液(2.34 μg·mL-1)、7 μL的DMSO及160 μL DTNB使用液(1.25 mmol·L-1)，将于25 ℃水浴中恒温20 min，然后加入9.4 μL碘化硫代乙酰胆碱使用液(1.87 mmol·L-1)，摇匀并置于25 ℃水浴中恒温1 min，在波长412 nm处并以蒸馏水为参比溶液，测其吸光度值(Acontrol)。以PBS缓冲溶液(0.01 mol·L-1)代替AChE使用液(2.34 μg·mL-1)做空白实验，重复上述步骤，测得空白值A0。

加入抑制剂AChE活性测定：在1 mL比色管中加入8 μL AChE使用液的同时加入一定量的芫花素使用液，根据加入的芫花素使用液体积调整PBS缓冲溶液的体积使总体积保持为700 μL，其它步骤与未加抑制剂AChE活性的测定相同，在波长412 nm处并以蒸馏水为参比溶液，测得加入一定量芫花素抑制剂后的吸光度值A。按照下式计算加入芫花素后的相对酶活力：

(1)

式(1)中：ΔAcontrol是未加芫花素抑制剂时测得的校正吸光度值；ΔAcontrol=Acontrol-A0；ΔA是加入芫花素后酶催化反应的校正吸光度值，ΔA=A-A0。

1.2.3 芫花素对乙酰胆碱酯酶的动力学特征

通过紫外分光光度计测得5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)吸光度值A的变化反映了AChE催化反应产物硫代胆碱浓度的变化。在不同芫花素浓度(0，5，10和15 μmol·L-1)下，固定催化反应温度为25 ℃，AChE的浓度为3.82×10-10mol·L-1，在AChE催化反应线性区间内，每间隔一定的时间，测定不同底物浓度(2.5，4，5，8，10，20和40 mmol·L-1)时反应产物硫代胆碱与显色剂DTNB生成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸的吸光度值A。用time(AChE催化反应时间)～A(测得的吸光度值)作图，得到的直线斜率反映了AChE催化反应的速率v[14-15]，接着按照 Lineweaver-Burk的双倒数作图法，可确定抑制作用的类型。

2 结果与讨论

2.1 AChE催化反应进程

固定AChE的浓度为3.82×10-10mol·L-1，硫代乙酰胆碱的初始浓度为2.51×10-5mol·L-1，记录412 nm处吸光度值随时间的变化，测得无抑制剂存在时和分别加入不同浓度的芫花素后AChE催化硫代乙酰胆碱分解的反应时间进程曲线如图1所示。由图1可见，吸光度值A随时间的变化曲线为过原点的直线，直线的斜率反映AChE催化反应的初速率v，可代表酶活。加入芫花素抑制剂后，直线的斜率变小，AChE催化反应速率随着芫花素的浓度增加而降低，单位时间内生成5-巯基-2-硝基苯甲酸的量减少，说明芫花素对AChE的催化活性具有抑制作用。

图1 加入不同浓度的芫花素后对AChE的催化反应速率的影响

2.2 芫花素对乙酰胆碱酯酶活力的抑制作用

由图1中每条直线的斜率与无抑制剂存在时直线的斜率的比值求得相对酶活力，作出了图2，此图体现了不同浓度的芫花素对AChE活性的影响。由图2可知，随着芫花素浓度的增加，AChE的相对酶活力逐渐降低。当芫花素的浓度在0～10 μmol·L-1范围时，相对酶活力与加入的芫花素浓度之间呈线性负相关关系(相关系数r>0.99)，线性拟合曲线为：相对酶活力=-0.054c(genkwanin)+0.9839。根据该线性拟合曲线求得50%抑制浓度(IC50)，即导致AChE酶活力下降50%所需的芫花素浓度为8.96 μmol·L-1，此结果表明AChE的活性受到芫花素的抑制，且抑制作用较强。因此芫花素可作为一种用来筛选AChE的抑制剂的参考配体。

图2 芫花素对AChE活性的影响

2.3 芫花素对乙酰胆碱酯酶活力的抑制动力学

为了进一步明确芫花素对乙酰胆碱酯酶抑制作用的机理，在测定酶活体系中，固定酶的浓度为3.82×10-10mol·L-1，在不同的芫花素浓度下，改变试液的底物碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)浓度([S])，测得这些试液的吸光度随时间的变化情况，从直线的斜率得到AChE催化反应的初速率v，再根据底物浓度([S])与初速率v作图，得到米氏(Michaelis-Menten)曲线(如图3所示)。由图3可知，酶促反应的动力学符合米氏(Michaelis-Menten)方程，因此可进一步研究芫花素对AChE的抑制类型。

图3 不同浓度芫花素下AChE的米氏曲线

在可逆抑制类型中，根据抑制剂、底物和酶三者的相互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制四种类型，可通过双倒数作图(Lineweaver-Burk作图法)进行判断[16]。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法即以不同的芫花素浓度下测得的AChE催化反应速率的倒数(1/[v])对底物浓度的倒数(1/[S])作图，如图4所示。

图4 芫花素对AChE抑制作用的双倒数图

由图4可知，无抑制剂存在时和加入不同浓度的芫花素后，得到的几条相交于第二象限的直线。因加入不同浓度的芫花素，这些直线与横轴和纵轴的交点都不同。本实验条件下，无抑制剂存在时AChE催化硫代酰胆碱分解的Lineweaver-Burk双倒数拟合曲线为：

(2)

根据公式(2)的斜率和截距计算出在温度为25 ℃时乙酰胆碱酯酶表观米氏常数Km为0.062 mmol·L-1，酶促反应的最大速率Vmax为0.962 mmol·L-1·min-1。图4可知乙酰胆碱酯酶的表观米氏常数(Km)随着芫花素浓度增大而增大，而酶促反应的最大速率(Vmax)随着芫花素浓度增大而减小。因此根据酶的可逆抑制动力学特征判断[16]，芫花素对乙酰胆碱酯酶的抑制作用机理表现为混合Ⅰ型竞争抑制。混合型抑制结果表明，芫花素既可以和游离酶(E)结合，也可以与酶-底物复合物(ES)结合，导致酶活力降低。

用抑制剂存在下的表观米氏常数Km或双倒数图斜率(简称一次作图斜率)对抑制剂浓度作图即两次作图法可求得抑制常数KI。因此，以Lineweaver-Burk双倒数图中直线的斜率对芫花素浓度作图，得到图5。图5中直线的反向延长线与X轴的交点即为芫花素对AChE的抑制常数的相反数，由此求得芫花素对AChE的抑制常数KI=5.77×10-6mol·L-1。又以Lineweaver-Burk双倒数图中直线与Y轴的截距对芫花素浓度作图，如图6所示，图中直线的反向延长线与X轴的交点即为芫花素对酶-底物络合物的抑制常数的相反数，由此求得芫花素对酶-底物络合物的抑制常数KIS=31.11×10-6mol·L-1，KIS值约为KI值的5.39倍，由此可知抑制常数KIS>KI，说明竞争性抑制强于反竞争性抑制，即芫花素对游离酶的抑制作用强于其对酶-底物复合物的抑制作用[17]。这种抑制类型往往是由于配体与酶的结合部位是对酶活性起重要作用的其它活性位点，而不是酶的活性中心。

图5 芫花素对AChE抑制常数KI的测定

图6 芫花素对AChE抑制常数KIS的测定

3 结 论

芫花素对AChE的抑制作用研究结果表明，加入芫花素后，酶催化反应速率显著降低。芫花素对AChE抑制作用的IC50为 8.96 μmol·L-1。芫花素对AChE的抑制作用表现为混合Ⅰ型的可逆抑制，芫花素对游离酶的抑制作用强于其对酶-底物复合物的抑制作用。本文的研究结果对进一步深入研究芫花素对AChE抑制作用的机理提供了依据。