藏药烈香杜鹃精油质量标准研究

祝清灿

［国药集团同济堂（贵州）制药有限公司，贵州 贵阳 550026］

藏药烈香杜鹃精油为杜鹃花科植物烈香杜鹃Rhododendron anthopogonoidesMaxim.、毛花杜鹃Rhododendron cephalanthumFranch.或报春花状杜鹃Rhododendron primulaeflarumBur.et Franch.的嫩枝叶及花经水蒸气蒸馏提取的挥发油，为淡黄色至棕黄色或淡绿色至黄绿色的液体，具有特异的香气，味辛，是藏药妇洁搽剂（收载于《国家中成药标准汇编》外科妇科分册）的主要成分之一［1-2］。烈香杜鹃精油中主要含有苄基丙酮（4-苯基-2-丁酮），尚含α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、大牻牛儿酮（杜鹃酮）、桧脑、γ-卡蒂烯等成分［3-6］，具有平喘、镇咳、抑菌、扩张血管等作用［7-10］。刘彬［11］对黄花杜鹃挥发油的抑菌作用进行了研究，发现以苯甲酸为阳性对照，黄花杜鹃挥发油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形菌、巨大芽孢杆菌的抑菌效果都比苯甲酸强。在藏族地区民间，烈香杜鹃叶广泛用于治疗支气管炎、喉炎、尿道炎、消化不良、胃下垂、胃扩张、水肿及手、足癣等皮肤病［12-13］。为了控制产品质量，确保临床疗效，本文对烈香杜鹃精油进行质量标准研究，采用薄层色谱法进行定性鉴别，并参照文献［14-17］采用气相色谱法（GC）对其中的苄基丙酮进行含量测定，为制定质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦6890A-5973 气质联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；AB104-N 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；ZF-I三用紫外分析仪（上海银泽仪器设备有限公司）；YOKO-ZS 薄层色谱成像仪（武汉药科新技术开发有限公司生产）。

1.2 试药与试剂 烈香杜鹃由青海省食品药品检验所杨凤梅主任鉴定，烈香杜鹃精油样品（批号：2015605、20151002、20160503、20170201、20171102、20180703、20181104、20181105、20190506、20191007），由青海普兰特药业有限公司生产；苄基丙酮对照品（北京百灵威科技有限公司，批号LA70N59，含量：99%）；烈香杜鹃油对照提取物（中国食品药品检定研究院，批号111657-200301）；化学试剂均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；硅胶G 预制板（德国默克公司生产，批号HX242369）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别 取本品20 mg，加乙酸乙酯2 ml使溶解，作为供试品溶液。另取烈香杜鹃油对照提取物，同法制成对照提取物溶液。再取苄基丙酮对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含10 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［18］试验，吸取上述3 种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。在日光下观察，供试品色谱中，在与对照提取物和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。结果见图1。

图1 烈香杜鹃精油薄层色谱图

2.2 苄基丙酮的GC法含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 取苄基丙酮对照品适量，精密称定，加正己烷制成每1 ml 含0.1 mg 的溶液，作为苄基丙酮对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取烈香杜鹃精油约0.1 g，精密称定，置50 ml 量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，得烈香杜鹃精油供试品溶液。

2.2.3 气相色谱条件与系统适用试验 色谱柱为TR-5 毛细管柱（30 m×0.32 mm，膜厚0.25 μm）；载气为高纯度氮气（纯度＞99.999%），流速1.0 ml/min；采用程序升温：初始温度为110 ℃，保持8 min 后，以50 ℃/min 的速率升温至220 ℃，保持2 min；进样口温度为220 ℃；检测器温度为240 ℃；分流进样，分流比为20∶1。理论板数按苄基丙酮峰计算应不低于5 000。见图2。

在上述色谱条件下，对照品苄基丙酮的出峰时间为5.845 min（图2-A），供试品色谱中，出现与对照品苄基丙酮相同保留时间的峰（图2-B），且与样品中其他组分色谱峰达到基线分离。

图2 烈香杜鹃精油及苄基丙酮GC图

2.2.4 专属性试验 对烈香杜鹃油供试品溶液进行气相-质谱联用分析，具体参数如下：色谱柱：DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯度氦气（纯度＞99.999%），流速0.7 ml/min；柱温为程序升温：初始温度为80 ℃，以7 ℃/min 的速率升温至240 ℃，保持8 min；进样口温度为250 ℃；检测器为260 ℃；分流进样，分流比为20∶1。电离方式：EI；离子源温度：230 ℃；连接线温度：280 ℃；四级杆温度：150 ℃。见图3、图4。

结果：在烈香杜鹃精油总离子流图中，保留时间为8.656 min的分子离子峰与苄基丙酮峰相似，其裂解与苄基丙酮相同。烈香杜鹃精油供试品中苄基丙酮峰质谱图与标准谱库（安捷伦Chemstation 色谱工作站NIST MS Search 2.0标准谱库）中苄基丙酮的质谱图匹配度为99%，其特征离子分别为148、105 和43，对应质谱碎片离子的质荷比与对照品一致，其丰度比偏差在规定范围内，因此可认为是同一物质。

图3 烈香杜鹃精油总离子流图和苄基丙酮峰质谱图

图4 苄基丙酮对照品总离子流图和苄基丙酮峰质谱图

2.2.5 标准曲线制备 精密称取苄基丙酮对照品0.253 2 g（含量按99.0%计算），置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，浓度为2.507 6 mg/ml。分别精密吸取对照品储备液1 ml、2 ml、3 ml、5 ml、10 ml，置50 ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，配制系列浓度对照品溶液，浓度分别为：0.050 1 mg/ml、0.1003mg/ml、0.1504mg/ml、0.2508mg/ml、0.5015mg/ml。精密吸取1.0 l，注入气相色谱仪，按照“2.2.3”项测定。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），苄基丙酮的线性回归方程为：Y=6 884 451.81X-873 8.65，r=0.999 6。结果表明：苄基丙酮进样量在0.050 1～0.501 5 μg 范围内，与色谱峰面积呈良好线性关系。

2.2.6 稳定性试验 取烈香杜鹃精油（批号20150605），按“2.2.2 供试品溶液制备”方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项测定，分别于 0 h、1 h、2.5 h、7.5 h、22 h 测定峰面积，供试品中苄基丙酮的峰面积平均值为1 102 237，RSD=1.9%（n=5），表明供试品溶液在22 h内基本稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批号烈香杜鹃精油样品（批号20150605），精密称取6 份，每份约0.1 g，精密称定，按“2.2.2 供试品溶液制备”方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项进行含量测定，结果苄基丙酮含量的平均值为84.79 mg/g，RSD 为1.9%（n=6），表明试验方法重复性良好。

2.2.8 加样回收试验 精密称取苄基丙酮对照品0.050 5 g（含量按99.0%计算），置50 ml 量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，备用（苄基丙酮浓度为1.000 7 mg/ml）。

取同一批号样品（批号20150605，苄基丙酮含量为 84.79 mg/g）各 6 份，每份约 0.05 g，精密称定，置50 ml 量瓶中，分别精密加入上述对照品溶液5 ml，按“2.2.2 供试品溶液制备”方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项测定含量，计算回收率，结果：苄基丙酮的平均回收率为98.21%，RSD=1.92%（n=6），表明试验方法的准确度较好。见表1。

2.2.9 样品的测定 取烈香杜鹃精油10 批，按照“2.2.2 供试品溶液制备”方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项测定苄基丙酮的含量，结果见表2。

表1 苄基丙酮加样回收试验测定结果 （n=6）

表2 样品含量测定结果

经过上述方法学验证和耐用性试验考察，结果表明：在本试验的色谱条件下对苄基丙酮的定量测定具有专属性强、重现性好、分离能力强、灵敏度高、操作简便等优点，可用于烈香杜鹃精油的质量控制。

3 讨 论

3.1 薄层色谱鉴别条件选择 采用环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶10∶1）、环己烷-乙酸乙酯（17∶3）、石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（20∶16∶1）等展开剂进行分离，其中以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶10∶1）分离效果最好，特征斑点清晰圆整。

3.2 气相色谱法供试品提取溶剂选择 苄基丙酮含量测定研究中，分别比较了正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚（30～60 ℃）为提取溶剂的苄基丙酮含量结果，结果表明：正己烷和乙酸乙酯作为提取溶剂，样品中苄基丙酮含量较高，但乙酸乙酯空白溶剂在苄基丙酮色谱峰位置有吸收峰，影响含量测定结果，故最终选用正己烷为提取溶剂。

3.3 气相色谱条件选择 采用不同的进样口温度（210 ℃、220 ℃、230 ℃）、不同的检测器温度（230 ℃、240 ℃、250 ℃）和不同的柱温（100 ℃、110 ℃、120 ℃）及不同厂牌（Thermo 和Agilent）和不同长度的毛细管柱（TR-5，30 m×0.32 mm，0.25 m 和 HP-5，25 m×0.32 mm，0.17 m）进行耐用性试验考察，结果表明，选择TR-5 毛细管柱（30 m×0.32 mm），进样口温度为220 ℃，检测器温度为240 ℃，柱温为110 ℃时分离效果最好。

由于烈香杜鹃精油中含有抑菌成分，广泛应用于临床及藏药制剂的生产，因此，建立烈香杜鹃精油的质量标准，有效控制精油质量显得尤为重要，本文的研究结果为制定其质量标准提供了科学依据。