人体肠道耐药基因组的研究进展

段宇婧，吴新颜，陈则友，陈颖,4，李林云，祝思源，毛大庆，罗义,2,*

1. 南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津 300350 2. 南京大学环境学院，污染控制与资源化国家重点实验室，南京 210093 3. 南开大学医学院，天津 300071 4. 辽宁大学环境学院，沈阳 110036

肠道微生物是人体最复杂的微生态系统，据估计人体肠道菌群数量是人体细胞总数的10倍之多[1-2]。作为20世纪最重要的医学发现之一，抗生素在治疗疾病、延长人类寿命方面发挥了重要作用，但是目前因抗生素滥用引发的耐药性问题已十分严重。抗生素选择性压力能促进耐药细菌和耐药基因(antibiotic resistance genes, ARGs)不断被筛选和富集，耐药基因还可以通过可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)在相同种属或不同种属的细菌之间进行水平转移，使更多的敏感菌成为耐药菌[3-4]。人体服用的抗生素进入肠道后形成的选择性压力可作用于肠道微生物并引起肠道菌群的改变。近年来，耐药基因组(resistome)的概念应运而生，包括所有耐药基因及其前体(隐匿性或原耐药基因)，这反映出耐药基因的复杂性[5-8]。肠道是耐药基因的“储存库”，研究发现人体肠道中存在上千种耐药基因，相较其他环境样品，人类肠道耐药基因组拥有较高的丰度和多样性，并且与人体健康息息相关，具有非常重要的研究意义[9-10]。本文首先介绍了人体肠道耐药基因组的研究方法，系统总结了肠道耐药基因组的组成和来源以及传播和进化方面的最新进展，在此基础上对今后的研究重点提出了建议与展望，以期为肠道耐药基因组的研究提供新思路，同时为临床抗生素的合理使用提供理论依据。

1 人体肠道耐药基因组的研究方法(The research methods of human gut resistome)

传统的微生物培养技术对于获得耐药菌株并阐明其表型和基因型具有不可替代的作用，但目前近80%的肠道细菌仍不可体外培养，该技术无法全面研究肠道耐药基因组(图1)[11-13]。一些分子生物学手段包括传统PCR技术、实时荧光定量PCR技术(qPCR)、高通量荧光定量PCR技术、基因芯片技术(又称DNA微阵列)和测序技术克服了分离培养技术存在的缺陷。其中，PCR技术和基因芯片技术可快速检出样品中耐药基因并测得其丰度高低，但也存在一定的缺陷，这些技术不能提供耐药基因的遗传背景和宿主信息，同时常出现的假阳性结果也会影响人们对真实情况的认知[13]。基因测序技术可有效避免上述缺点，其中，二代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS)凭借低成本和高通量，逐渐发展为目前的主流技术，但其存在序列读长较短且拼接过程较为复杂等缺陷。三代测序无需模板扩增，耗时较短并且读长更长，但是因其高错配率、高成本和低通量的局限性而难以得到广泛应用，现今仍处于发展和完善阶段。基因组测序、扩增子测序、转录组测序和宏基因组测序等技术发展迅速，已得到广泛应用，并衍生出相应的组学研究如基因组学和转录组学。宏基因组学(metagenomics)运用基因组学的研究策略来分析全部微生物的遗传信息，被广泛应用于探究环境或人体的微生物多样性、种群结构和功能基因等方面。可以通过比对数据库来分析测序结果，考察耐药基因的存在情况，目前可选用的相关数据库主要有CARD数据库(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)[14]、ARDB数据库(Antibiotic Resistance Gene Database)[15]、MvirDB[16]、ARGO数据库(Antibiotic Resistance Gene Online)[17]、Resfinder数据库[18]、Resfams数据库[19]和ARG-ANNOT数据库等[13,20]。

近年来，一些新兴的耐药基因组研究技术和方法也不断诞生，如基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)、微流控(microfluidic strategies)、拉曼光谱、单细胞测序和HiC-Meta技术等。基于贝叶斯算法建立的Source Tracker机器学习方法可以进行耐药基因溯源分析，如分析婴儿的肠道菌群和耐药基因是否来源于母体的肠道、阴道和皮肤菌群[21]。功能宏基因组(functional metagenomics)和培养组学(culturomics)的发展为深入探究肠道中耐药基因的存在、传播、机制、功能和健康风险提供了有效手段。功能宏基因组通过整合稳定同位素标记技术(DNA-SIP)或微流控技术来综合探究耐药基因的功能、活性和代谢产物，能够用于发掘新型的耐药基因[22-23]。但该技术也存在一定的缺陷，文库构建过程会发生基因丢失，宿主菌也不可能正确地表达全部插入的基因片段(图1)[13]。随着研究的不断深入，对于未知肠道细菌的探究需求日益迫切，准确获取肠道耐药菌株后，可继续开展菌种鉴定、体外实验或者模式生物实验等，这对于耐药基因的后续研究十分必要，而单纯的测序技术无法满足这一要求。目前，微生物培养技术整合基因测序技术经过发展和改良逐步形成了培养组学，已经将人体可培养细菌数目增加了上百种，为人类肠道细菌的培养和鉴定做出了巨大贡献。培养组学通过多种培养条件来进行大规模细菌培养，并结合MALDI-TOF-MS以及16S rRNA基因测序等技术来鉴定细菌物种[12]。MALDI-TOF-MS能够快速进行细菌物种鉴定，可以用于鉴定携带耐药基因的细菌，并且该技术能够进行细菌耐药表型的检测，如检测β-内酰胺酶的产生[24]。

图1 肠道耐药基因研究的主要技术路线[13]Fig. 1 Major technical routes for the study of gut resistome[13]

2 人体肠道耐药基因组的组成和来源(The composition and origin of human gut resistome)

2.1 人体肠道耐药基因组的组成及影响因素

作为耐药基因的“储存库”，肠道菌群的结构与耐药基因的组成密切相关[10]。人体肠道菌群和耐药基因的组成是一个由少到多、由简单到复杂、由不稳定到稳定的定植过程，二者都受年龄的影响[25-26]。Lu等[26]通过对124份4个不同年龄段的健康人群粪便样本研究发现,耐药基因的多样性和检出数目随着年龄升高而增加，依次为：学龄前儿童(3～5岁)<学龄期儿童(10～11岁)<高中青少年(15～17岁)<成年人(26～55岁)。成年人肠道耐药基因组的种类较为丰富，有研究通过蛋白质同源建模的方法预测人类肠道中存在6 095种耐药基因[27]。Hu等[9]在来自3个国家的共162份成人粪便样本中检测到1 093种耐药基因，分别属于149种耐药基因类型，并且同其他环境介质如土壤、海洋和湖泊相比，成人肠道耐药基因的丰度更高。据文献报道，四环素类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、万古霉素类和杆菌肽类耐药基因在全世界不同国家的人体肠道中均广泛存在，耐药基因tetW、tetM、tetO、tet32、ermF、aadE、acrB和vanS等在健康人群肠道中普遍检出并且相对丰度较高[9,28-29]。四环素类耐药基因是肠道细菌中最常见的类型，研究表明，肠道厌氧共生菌中普遍存在tetW，拟杆菌门中普遍能检出tetQ[30]。

除年龄影响外，研究者发现肠道耐药基因的组成还会受到药物、国家或地区、饮食及生活方式、经济收入和环境等多种因素的影响[25,31-32]。很多药物尤其是抗生素对肠道菌群以及耐药基因有显著影响。大量的研究证明，抗生素可降低肠道菌群的丰度和多样性，增加耐药基因丰度和数目，导致肠道菌群失调甚至难以完全恢复[11,33-36]。抗生素引起肠道菌群结构的改变是引起耐药基因组成发生变化的直接原因[29,34-35]。Palleja等[34]分析了12名健康成年男性在短期服用混合抗生素后的肠道菌群和耐药基因的变化，发现肠道菌群多样性变低，检出携带β-内酰胺类耐药基因的细菌，并且在随后的6个月恢复期内仍有多种肠道细菌未能恢复。Raymond等[35]的研究证明，口服头孢丙烯后，肠道β-内酰胺类耐药基因blacfx-6的突变增多，并且导致一些条件致病菌如阴沟肠杆菌的丰度增加。根据全球抗生素的消费情况与细菌耐药数据的统计分析发现，人类肠道中，丰度最高的耐药基因往往对应着使用历史更长久的抗生素，甚至一些兽用抗生素，这些兽用抗生素可能是通过食物链进入人体来影响肠道耐药基因组[37]。此外，非抗生素类药物也会改变肠道菌群和耐药基因，体外实验研究表明，许多药物能够像抗生素一样抑制肠道细菌，并可能促进细菌获得抗生素抗性[38]。抗癫痫药卡马西平能促进携带多重耐药基因的质粒在同属和不同属水平细菌间的水平转移，抗菌剂三氯生可以通过诱导基因突变来使大肠杆菌获得多重耐药性[39-40]。

国家或地区的差异对人群的肠道耐药基因也有影响，研究证实，不同国家的健康人群肠道耐药基因组的组成和丰度存在区别。Feng等[28]分析发现，来自相同国家的人群肠道耐药基因会倾向于相似，且不同国家人群拥有自己的代表性耐药基因(representative/discriminative ARGs)。例如，ermF和tetQ是中国人群的代表性耐药基因，万古霉素类耐药基因可同时作为奥地利、瑞典、日本和美国的代表性耐药基因。目前，已有多个研究证实，同西班牙、丹麦、法国、德国、瑞典和美国等欧美国家相比，中国人群肠道拥有更高丰度的耐药基因[9,28]。Häsler等[41]研究发现，2015年德国境内来自叙利亚、阿富汗和伊拉克的难民人群肠道中耐药基因与德国本地人群的肠道耐药基因存在差异，耐药基因vanC1、qnrB、blaOXA-1和blaCTX-M group 1在三国难民肠道中检出较多，而在德国本地人群肠道中耐药基因vanB普遍存在，qnrB和blaOXA-1则没有检出。

饮食及生活方式、经济收入和环境等因素也可能对肠道耐药基因组的组成与多样性有一定的影响[11]。非洲坦桑尼亚地区的哈扎人过着原始的生活，拒绝现代社会的生活方式，他们以狩猎采集为生，食谱包括猴面包树果实、各种肉类、浆果和蜂蜜等，几乎从未摄入过加工食品和抗生素。研究者发现，他们拥有更为丰富的肠道菌群，并且肠道中耐药基因多样性相较美国人要偏低，反映出饮食及生活方式对肠道耐药基因的影响[42]。来自低收入国家和工业化程度较低国家的人群与西方工业化国家相比，肠道耐药基因丰度倾向于更高，这说明，经济收入可能作为一种因素影响人体肠道耐药基因组组成[43]。如今，环境污染对人体健康的影响备受关注，一些环境污染物如重金属和抗生素等可通过食物链进入人体肠道，影响肠道菌群和耐药基因组的组成。此外，耐药基因在水环境、土壤和大气等介质中普遍存在，形成一个天然的耐药基因储存库，并且可能通过食物链进入人体肠道进一步影响肠道耐药基因组[44-48]。

2.2 人体肠道耐药基因组的来源

人体肠道微生物的来源与母体密切相关，从肠道、口腔、阴道和母乳来源的母体微生物可能通过母婴传播到达胎儿或新生儿的肠道并参与子代肠道菌群的早期定植，这些微生物也是子代肠道耐药基因的来源[49-50]。研究表明，在正常妊娠过程中，胎盘屏障并不能阻止微生物在母-胎之间的垂直传播[49]。长期以来人们认为子宫是一个无菌环境，以保障胎儿的健康发育，因此，前期观点认为胎儿是在生产过程中以及出生后开始获得肠道细菌的。近年来，随着分子生物学的不断发展以及测序技术的广泛应用，已开始有证据表明，孕妇子宫、羊水和胎盘中存在细菌，并且会直接影响胎儿肠道菌群的获得与定植，然而这些细菌对孕妇及胎儿生理健康的影响仍有待探究[50-51]。胎儿在妊娠16周时就可以吞入羊水，经过吸收后再通过尿液和胎便排出到宫腔中，胎便成分主要包括羊水、胎毛和掉落的细胞等。相关研究证实，胎便中存在细菌，并且有耐药基因的检出，如葡萄球菌、链球菌、肠球菌以及四环素类耐药基因和β-内酰胺类耐药基因等[49,50,52]。目前，胎便菌群的具体来源还未能完全确定，已报道的来源主要有母体的肠道菌群、阴道菌群以及口腔菌群，这些菌群可能通过胎盘屏障进入子宫和胎儿肠道中，其中，母体的肠道微生物可能是子代肠道菌群最重要的来源。研究表明，人类胎便中检出的埃希氏菌属和肠球菌属就是肠道常驻菌群[50,53]。此外，一些免疫细胞如树突状细胞能够携带微生物穿过肠道屏障进入肠道淋巴系统并进入血液当中，使得母体一些肠道微生物可能传播至胎盘和胎儿肠道中[54]。Jiménez等[50]将一株从人体获得的屎肠球菌荧光标记后让孕鼠口服摄入，在剖宫产后的羊水和子代的胎便中能够分离出该标记菌，进一步说明母体肠道中的细菌能够通过胎盘屏障进入子宫和胎儿肠道中。

新生儿的肠道菌群和耐药基因除了前期从母体子宫内获得外，还受到分娩过程和母乳喂养的影响[32,55-56]。顺产的新生儿在分娩过程中可以获得母亲的阴道菌群，如乳酸杆菌属、双歧杆菌属和普氏杆菌属等，剖宫产的新生儿肠道菌群与母体肠道菌群相似性较低，并且同顺产婴儿相比，剖宫产婴儿的肠道菌群倾向于携带更大比例的耐药基因，在医院出生的新生儿还可能受到周围环境中耐药细菌的威胁[32,56]。在新生儿成长过程中，母乳喂养也会影响婴儿的肠道菌群、耐药基因组和可移动遗传元件。母乳中有检出乳杆菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和链球菌属，以及mecA和ermB等耐药基因，并且可移动遗传元件的存在可能会促进耐药基因在母婴之间的传播扩散[55,57]。

3 人体肠道耐药基因组的传播和进化(The propagation and evolution of human gut resistome)

3.1 肠道耐药基因组的传播

人体肠道微生物及其携带的耐药基因可以通过城市污水处理厂出水排放进入环境，从而影响环境中的耐药基因组[10,58-59]。传统的粪便污染指示菌如大肠杆菌、拟杆菌属和双歧杆菌属可以用来探究水环境的粪便污染。近期有文献报道，噬菌体crAssphage也可以作为环境中人类粪便污染的示踪标记，借助该标记的研究证明人类粪便的排放能够影响环境中耐药基因的组成[59]。此外，耐药基因也可以通过动物携带传播、河流和风力等自然作用传播以及医院和社区的人际传播等途径进入人体[10]。一些在北极生活的候鸟迁徙路径可横跨六大洲，耐药基因可能借助这些动物进行远距离传播[4]。已有研究表明，在食品、饮用水和雾霾样品中都检出了耐药基因，这些耐药基因可能通过食物链和呼吸等暴露途径进入人体[44-48]。2016年，我国在零售肉类、养殖场及环境中发现分离的大肠杆菌质粒上携带多粘菌素耐药基因mcr-1，这是首次被发现的可以通过质粒在不同菌属之间传播扩散的多粘菌素耐药基因[46]。目前，已证实该基因在全球35个不同国家和地区的人、动物和环境源等的多种肠杆菌中广泛传播，引起世界范围的广泛关注。

在微观分子水平上，耐药基因的传播方式可以分为垂直基因传递和水平基因转移。垂直基因转移是由亲代将遗传信息传递给下一代，水平基因转移可以在同种属和不同种属之间交换遗传物质。细菌耐药性可以分为固有耐药/天然耐药(intrinsic resistance)和获得性耐药(acquired resistance)。固有耐药是由细菌染色体上位置保守的固有耐药基因决定，赋予细菌对抗生素天然耐药的特性，可以通过垂直基因传递将耐药基因传递给子代[60-61]。获得性耐药是由于敏感菌发生基因突变或者获得外源性耐药基因而产生的。敏感菌可以通过质粒(plasmid)、转座子(transposon)、整合子(integron)和噬菌体(phage)等可移动遗传元件(MGEs)以转化(transformation)、接合(conjugation)和转导(transduction)等水平基因转移的方式获得外源性耐药基因，从而成为耐药细菌来抵抗外界抗生素的胁迫，给临床抗感染治疗带来巨大的困难和挑战(图2)[3-4,62]。转化是受体细菌可以从周围环境中直接获取DNA片段，并整合表达从而获得耐药性；接合是通过供体菌和受体菌的性菌毛接触形成通道来进行基因交流，接合转移的载体多为可自主转移的质粒或接合性转座子；转导是噬菌体在脱离原宿主菌并重新组装成子代噬菌体时，会携带部分原宿主菌基因如耐药基因，在侵染新宿主菌同时将耐药基因整合到宿主菌上，使其表现出耐药性[62]。有报道指出，在哺乳动物肠道中，耐药基因更倾向于通过接合和转导来进行水平基因转移，而不是转化[13,63]。研究证明，肠道厚壁菌门的厌氧菌可以通过接合的方式将万古霉素类耐药基因vanB传给条件致病菌[64-65]。拟杆菌属肠道细菌能通过接合性转座子CTnDOT传播耐药基因使得其他细菌获得四环素和红霉素耐药性，并且低浓度四环素暴露可以进一步促进该转座子对耐药基因的接合转移[66]。近年来，学者们发现噬菌体也是肠道微生物生态系统的重要组成部分，与人类疾病和健康存在密切联系，并且是耐药基因水平转移的重要元件[67]。针对80位健康志愿者的粪便样品的研究证实，>70%的样品中的噬菌体携带至少一种耐药基因如blaTEM、blaCTX-M-1和qnrA等[68]。此外，研究者发现，口服抗生素能够增高小鼠肠道噬菌体中耐药基因的丰度，并促进噬菌体对耐药基因的水平转移[69]。

图2 水平基因转移的3种主要方式[3,62]注：ARG表示耐药基因。Fig. 2 Three main mechanisms of horizontal gene transfer [3,62]Note: ARG stands for antibiotic resistance genes.

3.2 肠道耐药基因组的进化

在1928年Alexander Fleming发现青霉素前，具有耐药性的细菌早已在地球上出现，在距今约400万年的洞穴断层样品和3万年前的永久冻土中检出了耐药细菌和耐药基因[8,70-71]。同时，Santiago-Rodriguez等[72]在11世纪的木乃伊肠道中发现了β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类和氨基糖苷类等耐药基因，证明细菌耐药现象在人类肠道中早已存在，肠道耐药细菌并非都是因服用抗生素形成的选择压力而筛选出来的。综合众多人体肠道、土壤和冰川等不同生态系统中耐药基因的研究成果，学者们推测所有耐药基因都起源于远古时期环境中产抗生素细菌携带的前体耐药基因(precursor-resistant genes)，这些基因在自然条件下不断进化和传播，是一个缓慢并随机的过程[5-7,73]。抗生素本身就是一些细菌和真菌等微生物的次级代谢产物，这些微生物同时也演化出相应的耐药机制来避免自身受到抗生素的胁迫，从而在生存竞争中具备一定的优势，这种耐药性是自然界固有的一种特性[74]。固有耐药基因可能是一些获得性耐药基因的来源，已有研究表明，固有耐药基因能够被可移动遗传元件捕获进而传播至其他细菌中[75]。此外，获得性耐药也可以通过基因突变产生，当耐药基因编码的蛋白发生个别氨基酸位点变化时，就可能导致新的变体(variants)出现，使酶的水解底物范围产生差异。β-内酰胺类抗生素为临床最常用的一类抗菌药物，到如今β-内酰胺类耐药基因的很多亚型已拥有众多变体，如TEM(>200种)、SHV(>160种)和CTX-M类(>130种) (http://www.lahey.org/studies/webt.htm)。TEM-1在1960年首次被发现可以通过质粒携带传播，该酶可以水解青霉素和初代头孢菌素，之后陆续发现该酶基因点突变后形成的变体，如TEM-2和TEM-3等[76]。TEM-3最初于1989年发现，并作为第一个可归为超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases, ESBLs)的TEM耐药基因。

虽然，细菌耐药性并非因现代抗生素的应用而产生，但近年来抗生素的滥用显著加速了肠道耐药基因的进化和传播。目前，抗生素在临床和养殖业中都存在不合理使用及持续滥用的情况，大部分抗生素不能够被人类或动物充分吸收[77]。剩余抗生素形成选择性压力，一方面能杀灭或抑制敏感细菌，降低其对耐药细菌的生存竞争，促进耐药基因和耐药细菌不断被筛选和富集；另一方面抗生素促进了耐药基因在不同细菌间的水平转移和传播，水平基因转移不仅发生在同种细菌中，甚至发生在不同种属的细菌中，使得部分敏感细菌获得耐药性，这在细菌耐药性的进化过程中起到重要作用。同自然环境相比，医院中抗生素的使用剂量更高，加剧了肠道耐药基因的进化速度，在诸多压力的“层层选拔”下，多重耐药细菌的生存优势更为明显，它们能够对几种抗生素同时耐药，给临床治疗造成巨大的风险。研究者发现，超广谱β-内酰胺酶的大量出现与1980年后头孢菌素在临床上的普遍应用有关，该类酶能够对青霉素类及初代、二代和三代头孢菌素耐药，产ESBLs菌已经成为医院感染的重要因素[78-79]。通过对23个欧洲国家的抗生素使用与耐药细菌分析后发现，欧洲的细菌耐药情况与医疗中β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素广泛使用有关[80]。对美国在1950—2002年间从人体和食用动物的粪便、血液和尿液等中分离得到的大肠杆菌的耐药性进行分析后发现，耐药性进化与临床新型抗生素市场化有直接关系[81]。

4 人体肠道耐药基因组的研究展望(The future prospect of human gut resistome)

人类与病原微生物的斗争是一场永恒的博弈，抗生素的滥用加速了肠道微生物耐药基因组的进化，导致了对多种抗生素耐药的“超级细菌”的催生与传播，其同埃博拉病毒、SARS冠状病毒和最新发现的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等都对人类生命健康构成严重威胁。如今细菌耐药形势已经非常严峻，人体肠道耐药基因组及耐药细菌研究的学术意义和应用价值不言而喻，未来的研究重点应集中在以下几个方面：

(1)统一实验操作流程、实现人体肠道耐药基因组的标准化分析对于该领域的研究具有非常重要的意义，相关分子生物学和生物信息学方法以及技术平台也有待提升。

(2)有关人类肠道耐药基因组的组成分布和影响因素的研究尚未完善，还有待全面深入的探究，新型耐药基因仍在不断被发现，耐药基因数据库仍需不断补充和完善。全球人群类型众多，加之影响肠道耐药基因组的因素非常复杂，该领域大规模、多种类的人群样品尤其是人群队列样品的研究数据仍十分缺乏，亟待建立大数据研究平台。

(3)对肠道耐药基因的具体传播途径仍缺乏足够的认识，耐药基因在肠道菌群尤其是致病菌间的传播机制、在母婴之间的迁移规律以及在环境—动物—人体多介质之中传播扩散的研究还有待新的进展，只有了解各个环节的传播途径，才能有效遏制全球细菌耐药性的传播。

(4)关于人体肠道耐药基因组健康风险的量化评估有待深入研究，从而为临床耐药菌感染的诊治提供参考依据。在精准医疗的推动下，基于肠道耐药基因组和耐药细菌的个性化诊疗是未来的发展趋势。

(5)为了应对细菌耐药性的威胁，在临床耐药监测体系基础上，进一步加强全球环境耐药性监控体系建设是防控细菌耐药危机和评估细菌耐药性风险的重要手段。

(6)应用“One Health”策略探究肠道耐药基因是未来的研究重点，随着肠道耐药基因组研究规模的不断扩大，开展跨领域合作显得愈加重要。全球生态环境在病原体的传播中不容忽视，“One Health”的理念旨在建立一个跨学科、跨地区交流的全球合作策略，关注人类、动物和环境三者的相互影响，从而让全球更好地应对新发传染病、细菌耐药、食品安全和环境污染等问题[82-84]。在面对世界公共卫生问题和生态环境问题时，没有一个国家能独善其身，我们应当树立“人类命运共同体”意识，人类只有一个地球，全球的利益也是自身的利益。

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