LncRNA SOX2OT海绵吸附miR-34a促进SOX2表达增强大肠癌多药耐药

郭飘婷 邹阳

大肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，据美国癌症协会公布的数据显示，大肠癌是发病率和死亡率最高的消化系统恶性肿瘤[1]。化疗是大肠癌的主要治疗手段之一[2-3]，而多药耐药是大肠癌化疗失败的重要原因[4-6]。表观遗传的改变与大肠癌的发生发展密切相关[7-8]，作为长链非编码RNA(lncRNA)之一的SOX2OT本身不编码蛋白质，但可通过表观遗传、转录、转录后等多个层次参与基因表达的调控，发挥相应的生物学功能[9-11]。近年来，多项研究发现，SOX2OT在肿瘤发生过程中过表达或表达抑制，作为癌基因或抑癌基因而发挥作用[12]，但其在大肠癌中的表达水平、对耐药性的调节及其上下游分子机制尚不明。本研究检测SOX2OT对大肠癌HCT-116细胞化疗抵抗性细胞生物学行为的影响，并进一步探讨SOX2OT通过靶向调控下游基因介导HCT-116化疗抵抗作用的确切机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠癌细胞HCT-116购自上海中科院细胞库。5-FU、CDDP购自美国Sigma公司；长春新碱(VCR)购自深圳万乐药业有限公司；Taxol购自Bristol-Myers Squibb公司；TRIzol、BCP购自Sigma公司；异丙醇购自Acros organics公司；RNA反转录试剂盒购自Promega公司；SYBR购自Thermo公司；DMEM培养基、胰酶购自GIBCO公司；胎牛血清购自BI公司；SOX2OT质粒及空白质粒、pMIR-SOX2OT-Luc质粒、pMIR-Mut SOX2OT-Luc质粒、pMIR-SOX2-Luc质粒、pMIR-Mut SOX2-Luc质粒由全基因合成；双荧光素酶报告分析系统试剂盒购自Promega公司；miR-34a mimic、模拟物对照(NC mimic)购自上海吉玛公司。引物由上海桑尼公司合成，β-actin-F(5′ to 3′)：AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCA，β-actin-R(5′ to 3′)：GGCGGGCACGTTGAAGGTCT；SOX2OT-F(5′ to 3′)：GCATCTCTGCAAGGTAGGTT，SOX2OT-R(5′ to 3′)：GGCCATGAACTGACTCGAAA；SOX2-F(5′ to 3′)：CGGCAATAGCATGGCGA，SOX2-R(5′ to 3′)：CATGGAGTTGTACTGCAGGG；U6-F(5′ to 3′)：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-R(5′ to 3′)：AACGCTTCACGAATTTGCGT；miR-34a RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACTGGCAG；miR-34a-F(5′ to 3′)：GGGTCCGAGGTAT，miR-34a-R(5′ to 3′)：ACAACCAGCTAAGACA。

1.2 细胞培养

HCT-116细胞用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基，在5% CO237℃恒温箱内培养，待细胞长至80%～90%时按1∶2 ～1∶4的密度传代，每2～3天传代1次，取其对数生长期用于实验。

1.3 细胞转染

将细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，置于孵育箱中培养，待细胞长至70～80%。构建SOX2OT过表达的大肠癌HCT-116细胞：通过全基因合成pcDNA3.1-SOX2OT重组质粒和空质粒pcDNA3.1，用Lipo2000将其分别转染HCT-116细胞，设为SOX2OT组和Control组；构建miR-34a过表达的大肠癌HCT-116细胞：用Lipo2000分别将NC mimic、miR-34a mimic转染细胞，设为NC mimic组和miR-34a mimic组。分别在转染24 h和48 h后，提取总RNA，荧光定量PCR检验lncRNA SOX2OT、miR-34a的过表达效率以确定最佳转染时间。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

实验分为以下三组：Control+NC mimic(转染NC minic)、SOX2OT+NC mimic(共转染SOX2OT、NC mimic)、SOX2OT+miR-34a(共转染SOX2OT、miR-34a mimic)。取对数生长期HCT-116细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以5×103个/孔的浓度接种于96孔板中，每孔加入100 μL完全培养基。过夜贴壁后加入5个浓度梯度的5-FU、VCR、CDDP和TAXOL，每孔设3个复孔，孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，待其完全混匀，放入孵箱中继续培养2 h。用酶标仪测定各孔OD值(测定波长450 nm，参比波长650 nm)。计算5-氟嘧啶(5-Fu)、长春新碱(VCR)、顺铂(CDDP)、紫杉醇(TAXOL)四种化疗药物对HCT-116细胞的半数抑制浓度(IC50)、耐药指数(Resistance Factor，RF)和逆转倍数(Reverse index，RI)。RF=SOX2OT+NC mimic组IC50值/Control+NC mimic组IC50值；RI=SOX2OT+NC mimic组IC50值/SOX2OT+miR-34a组IC50值。实验独立重复三次。

1.5 双荧光素酶报告基因检测

借助生物信息学数据库miRcode网站，发现miR-34a同时与SOX2OT、SOX2存在互补序列，分别利用LncBase Predicted v.2和bibiserv网站预测到miR-34a与SOX2OT、SOX2的结合序列。构建pMIR-SOX2OT-Luc、pMIR-SOX2-Luc质粒，对miR-34a在SOX2OT、SOX2的潜在结合序列进行反义突变，合成pMIR-Mut SOX2OT-Luc质粒、pMIR-Mut SOX2-Luc质粒。基因测序鉴定后，用于双荧光素酶报告基因实验，以确定miR-34a与SOX2OT、SOX2结合具体位点及序列。

验证SOX2OT与miR-34a的结合关系时，设置分组：pMIR-SOX2OT-Luc+NC mimic组(pMIR-SOX2OT-Luc与NC mimic共转染细胞24 h)、pMIR-Mut SOX2OT-Luc+NC mimic组(pMIR-Mut SOX2OT-Luc与NC mimic共转染细胞24 h)、pMIR-SOX2OT-Luc+miR-34a mimic组(pMIR-SOX2OT-Luc与miR-34a mimic共转染细胞24 h)、pMIR-Mut SOX2OT-Luc+miR-34a mimic组(pMIR-Mut SOX2OT-Luc与miR-34a mimic共转染细胞24 h)；验证SOX2与miR-34a的结合关系时，设置分组：pMIR-SOX2-Luc+NC mimic组(pMIR-SOX2-Luc与NC mimic共转染细胞24 h)、pMIR-Mut SOX2-Luc+NC mimic组(pMIR-Mut SOX2-Luc与NC mimic共转染细胞24 h)、pMIR-SOX2-Luc+miR-34a mimic组(pMIR-SOX2-Luc与miR-34a mimic共转染细胞24 h)、pMIR-Mut SOX2-Luc+miR-34a mimic组(pMIR-Mut SOX2-Luc与miR-34a mimic共转染细胞24 h)。

将HCT-116细胞接种于96孔板，培养24 h，使其细胞融合度达到80%，按上述实验条件进行质粒转染。每孔加入100 μL 1×裂解缓冲液裂解细胞。离心，取20 μL上清加入到96孔板中，再加入50 μL LAR II，置于检测仪检测。检测结束后，取出96孔板，再加入50 μL Stop &Glo®Reagent，再次置于检测仪检测。计算相对荧光强度。实验独立重复三次。

1.6 荧光定量PCR

采用TRIzol一步法提取总RNA。计算出1.5 μg RNA需要量，用DEPC-H2O补充至13 μL，SOX2OT、miR-34a、SOX2逆转录时，每个样本中分别再加入1 μL Random，miR-34a RT引物及oligo dT，70℃下静置5 min后置于冰上。按SYBR Green实时PCR试剂盒说明进行RNA逆转录及PCR反应，共计40个循环。以2-△△CT法计算待测样本mRNA相对表达量。实验独立重复三次。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 miR-34a与SOX2OT、SOX2的结合关系验证

图1A为miR-34a与SOX2OT的预测结合序列。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与pMIR-SOX2OT-Luc+NC mimic组相比，pMIR-SOX2OT-Luc+miR-34a mimic组的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)；而pMIR-Mut SOX2OT-Luc+miR-34a mimic组的荧光素酶活性与pMIR-Mut SOX2OT-Luc+NC mimic组相比无统计学差异(P>0.05)(图1B)。

图1 验证miR-34a与SOX2OT、SOX2的靶向结合Figure 1 Verify the targeted binding of miR-34a to SOX2OT and SOX2Note：A.The predicted combination sequence of SOX2OT and miR-34a；B.The binding site of SOX2OT and miR-34a was confirmed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay；C.The predicted combination sequence of SOX2 and miR-34a；D.The binding site of SOX2 and miR-34a was confirmed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay.**P<0.01.

图1C为miR-34a与SOX2的预测结合序列。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与pMIR-SOX2-Luc+NC mimic组相比，pMIR-SOX2-Luc+miR-34a mimic组的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)；而pMIR-Mut SOX2-Luc+miR-34a mimic组的荧光素酶活性与pMIR-Mut SOX2-Luc+NC mimic组相比无统计学差异(P>0.05)(图1D)。

2.2 SOX2OT、miR-34a过表达效果鉴定

荧光定量PCR结果表明，HCT-116细胞中SOX2OT、miR-34a过表达有效，转染24 h时SOX2OT、miR-34a的过表达效率更高(P<0.01)，因此后续实验将选择24 h作为SOX2OT和miR-34a的最佳转染时间(图2A，2B)。

2.3 SOX2OT与miR-34a相互负向调节

qRT-PCR检测HCT-116细胞中SOX2OT过表达后miR-34a的表达水平，发现与Control组相比，miR-34a表达明显下降(P<0.05)(图3A)。过表达miR-34a，SOX2OT表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)(图3B)。

2.4 miR-34a可逆转由SOX2OT导致的HCT-116细胞多药耐药

CCK-8结果显示，SOX2OT+NC mimic组细胞对各化疗药物IC50值较Control+NC mimic组显著升高(P<0.01)，提示过表达SOX2OT增强HCT-116细胞对各化疗药物的抗药性(表1)。

共转染组SOX2OT+miR-34a组5-FU，VCR，CDDP，TAXOL的IC50值与SOX2OT+NC mimic组IC50值相比均显著下降(P<0.01)，其中5-FU、CDDP的IC50值与Control+NC mimic无统计学差异(P>0.05)。

2.5 SOX2OT作为海绵吸附miR-34a促进SOX2的表达

qRT-PCR检测发现，转染miR-34a mimic后，SOX2表达下降(P<0.01)(图4A)，说明SOX2是miR-34a的一个功能性靶标。与此同时，转染pcDNA3.1-SOX2OT重组质粒后，SOX2表达增加(P<0.01)(图4B)。综上表明SOX2OT作为海绵吸附miR-34a从而促进SOX2的表达。

图2 SOX2OT、miR-34a过表达效果检测Figure 2 The overexpression efficiency testing of SOX2OT and miR-34aNote：A.Verify the overexpression of SOX2OT.**P<0.01，when compared with Control group；B.Verify the overexpression of miR-34a.**P<0.01，when compared with NC mimic group.

图3 RT-qPCR验证SOX2OT与miR-34a的负性调控Figure 3 The negative regulation of SOX2OT and miR-34a was verified by RT-qPCRNote：A.Detection of miR-34a expression level by qRT-PCR.*P<0.05，when compared with control group；B.Detection of SOX2OT expression level by qRT-PCR.**P<0.01，when compared with NC mimic group.

表1 HCT-116细胞对不同种类化疗药物的IC50值

图4 SOX2OT海绵吸附miR-34a上调SOX2Figure 4 SOX2OT sponged miR-34a to upregulate SOX2Note：A.miR-34a down-regulates SOX2 expression.**P<0.01，when compared with NC mimic group；B.SOX2OT up-regulates SOX2 expression.**P<0.01，when compared with Control group.

3 讨论

目前大肠癌的治疗主要包括手术和化疗，其中早期大肠癌治疗仍首选手术切除，但对于失去手术机会或术后复发转移的晚期患者，化疗则是延长生存期的主要治疗手段[13]。多种结构不同、作用机制不同的抗癌药物，能在短期内缓解大肠癌患者病情，然而所有针对肿瘤细胞的治疗往往会由于基因突变而形成耐药，使得大肠癌的治疗十分棘手。肿瘤MDR指的是肿瘤细胞不仅对一种抗肿瘤药物产生耐药性，对其他多种结构以及作用靶点不同的抗肿瘤药物同时产生抗药性的现象[14]，探寻MDR的有效逆转策略和高效低毒的逆转剂成为目前肿瘤治疗的热点，也是肿瘤治疗新的领域。

lncRNAs是包含最大人类基因组的多种类非编码RNA，转录本长度超过200个核苷酸。虽仅有1%～2%的转录因子具有蛋白翻译的能力，lncRNAs可通过染色质重塑、转录调控以及转录后等多途径参与机体的表观遗传调控[15]。SOX2基因嵌入非编码RNA的内含子区，引起SOX2重叠转录，称为SOX2OT(SRY-box 2 overlapping transcript)[16]。研究显示在胰腺癌[17]、乳腺癌[18]等多种恶性肿瘤中均存在SOX2OT异常表达，Zhang等[19]研究发现，SOX2OT在胃癌组织和细胞系中比正常胃组织、正常胃上皮细胞系明显增高，其表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移以及远处转移、临床分期密切相关，提示SOX2OT可作为临床有用的诊断或预后生物标记物或癌症治疗靶点。目前SOX2OT在大肠癌HCT-116细胞耐药中发挥的角色仍不清晰，其对大肠癌耐药产生影响的具体机制有待明确。

微小RNA(miRNAs)是一类非编码小分子RNA，长度一般为18～22个核苷酸分子[20]。LncRNA可作为竞争性内源RNA(ceRNA)，通过海绵机制结合miRNA，从而降低miRNA活性，间接上调miRNA相关靶基因的表达[21]。miR-34a属于miR-34家族，位于人染色体1p36.22位点上。多项研究证明，miR-34a在乳腺癌[22]、胶质母细胞瘤[23]等肿瘤组织中呈低表达，发挥抑制增殖、逆转耐药等功能，但在miR-34a与SOX2OT互作并参与大肠癌耐药性调控方面目前暂无相关文献报道。

本研究以人大肠癌细胞HCT-116为研究对象，构建SOX2OT、miR-34a过表达大肠癌细胞模型，发现过表达SOX2OT可抑制miR-34a，上调SOX2表达；过表达miR-34a可同时下调SOX2OT、SOX2水平。CCK-8检测证明SOX2OT过表达后HCT-116细胞对化疗药物5-FU、VCR、CDDP和TAXOL的敏感性降低，而miR-34a逆转由SOX2OT导致的化疗抵抗。结合我们通过生物信息学的方法发现的结论：miR-34a与SOX2OT、SOX2同时存在互补序列，基于此我们进一步挖掘出miR-34a与SOX2OT、SOX2之间的潜在结合位点，获取结合序列，通过设计并化学合成可能作用位点反义突变处理的突变型重组双荧光素酶基因报告载体。运用双荧光素酶报告基因技术证明miR-34a可与SOX2OT和SOX2进行靶向结合。以上实验充分证实在大肠癌细胞HCT-116中SOX2OT作为海绵吸附miR-34a从而促进SOX2的表达，进而导致多药耐药。

综上所述，本研究揭示了SOX2OT增强大肠癌HCT-116细胞多药耐药，其作用机制与海绵吸附miR-34a从而促进SOX2的表达有关。SOX2OT可能作为抗癌药物的作用靶点。