美国白蛾幼虫消化道形态和超微结构观察

王光宇，赵兴鹏，王秀吉，赵京芬，陈 敏*

(1. 北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室，北京 100083；2. 甘肃省祁连山水源涵养林研究院，甘肃张掖 734000； 3. 北京市丰台区园林绿化局林业工作站，北京 100055)

美国白蛾HyphantriacuneaDrury，又称秋幕毛虫，属鳞翅目Lepidoptera灯蛾科Arctiidae，是我国最重要的外来入侵害虫之一，也是国际性检疫害虫。美国白蛾原产于北美，后传入欧洲和亚洲(罗立平，2018)。我国1979年首次在辽宁省丹东地区发现该害虫(于长义，1993)。目前，我国疫区已扩散至13个省(区、市)共计589个县级行政区(国家林业和草原局2019年第7号公告)。该害虫寄主范围非常广泛，世界范围内的寄主植物超过600多种(Sullivan, 2012)，在我国主要危害桑NorusalbaL.、洋白蜡FraxinuspennsylvanicaMarsh、臭椿AilanthusaltissimaMill等(李路莎等，2018)，对我国的林业生产和生态环境造成巨大破坏。昆虫的消化道结构会直接影响其运输、消化、吸收营养成分的效率(Basseyetal., 2006; 张小民等，2007)。对美国白蛾消化道的形态和结构的研究，有助于解释其多食性、耐饥饿能力强等生物学习性。

由于生存环境和食料的多样化，昆虫不同类群的消化道的形态和结构存在很大差异(李庆龙, 2015)。南宫自艳等(2015)通过扫描电子显微镜观察，发现大蜡螟GalleriamellonellaZinne幼虫的前胃内膜上具有棘状结构，并推测此结构与取食蜂蜡类食物相关；Chen等(2016a)对舞毒蛾LymantriadisparL.幼虫消化道进行研究，详细描述了舞毒蛾消化道各部分的组织、形态及功能。程云吉(1998)通过对棉铃虫Helicoverpaarmigera消化道及马氏管的解剖，阐明了幼虫期至化蛹前期马氏管的变化，并讨论了鳞翅目幼虫经蛹期转变为成虫过程中马氏管的变化存在的两种不同形式。Correia(2009)发现斜纹夜蛾ProdenialituraFabriciu幼虫取食喷洒了印楝素(Neemseto)的叶子后，消化道的形态发生了改变；Grant(2006)通过对比受到外界刺激的鳞翅目幼虫的消化道各部分的比例与回流现象的关系，发现前肠占比大、中肠占比较小的消化道的回流现象更加明显。一些鳞翅目幼虫则利用其回流的生物学习性作为抵御和阻止无脊椎动物攻击的最有效防御手段之一(Gentry and Dyr, 2002)。

本研究通过对美国白蛾6龄幼虫消化系统的石蜡切片显微观察，结合扫描电子显微镜与透射电子显微镜技术，对美国白蛾消化系统的形态结构进行描述分析，为阐明美国白蛾消化道各结构的功能及其生理机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

试验所用的美国白蛾幼虫为实验室人工饲料饲养，人工饲料配方和饲养方法参照曹利军等(2014)的方法。饲养条件：25℃，光照16 h ∶8 h，湿度70%～80%。选取生长状况良好、大小相同的6龄幼虫，于75%乙醇中保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1光学显微镜观察

1.2.1.1 消化道整体观察

取出美国白蛾6龄幼虫，用解剖剪和镊子沿腹部末端中线解剖虫体，小心取出整个消化道，将消化道外壁的气管及脂肪体去除，用0.1 M(pH=7.4)的磷酸盐缓冲液冲洗干净，用体视显微镜Leica M205FA拍照，识别消化道各部分，共解剖了50头美国白蛾6龄幼虫，对其前肠、中肠、后肠的长度进行测量。

1.2.1.2 石蜡切片观察

美国白蛾6龄幼虫石蜡切片的制作参照Baggio(2014)的方法。将解剖好的消化道浸入Duboseq-Brasil固定液固定24 h。经30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液逐级脱水。用二甲苯进行透明，石蜡包埋。用手动切片机(Leica RM2126RT)切片，厚度为7 μm。将切片置于两缸二甲苯中脱蜡两次，每次20 min，后用二甲苯、乙醇(1 ∶1)溶液→无水乙醇→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→蒸馏水处理，在2.5%铁矾液中咬色15 min，经蒸馏水漂洗后，再置于钾矾苏木精染色剂中染色15 min。然后脱水至90%酒精后，将切片放到95%酒精伊红染色剂中作双重染色。将染好色的切片经30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇、伊红→95%乙醇→无水乙醇，逐级脱水各5 min，然后经1/2无水乙醇+1/2二甲苯→二甲苯透明3 min。最后用中性树胶封片，利用光学显微镜(Axio Zoom.V16)对组织切片进行观察分析。

1.2.2扫描电子显微镜观察

扫描电子显微观察参照Chen(2016a)的方法，将冲洗过的幼虫消化道用2.5%的戊二醛固定液(PBS 0.1 M，pH=7.4)在4℃下固定24 min，然后用PBS冲洗3次，再用重蒸水冲洗。为了观察消化道的内部结构，在脱水前先用解剖剪解剖，再用磷酸缓冲液(0.1 M，pH=7.4)将内容物冲洗掉。分别用50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度脱水15 min；脱水结束后，用乙醇-叔丁醇溶液(1 ∶1，V/V)置换20 min，最后用100%叔丁醇置换两次，每次30 min。将处理好的样品在-20℃条件下预冷1 h，再在冷冻干燥仪(ES-2030)中进行冷冻干燥处理。干燥后的样品使用离子溅射仪喷镀后，进行扫描电子显微镜(日立S-3400N II)观察和拍照。

1.2.3透射电子显微镜观察

透射电子显微观察参照Wang等(2018)的方法，将消化道放入2.5%戊二醛固定液(PBS 0.1 M，pH=7.4)中固定24 h，固定后用0.1 M(pH=7.4)的磷酸盐缓冲液重复漂洗20次。清洗后的样品加入1%锇酸溶液固定3 h，再用磷酸缓冲液冲洗两次。依次用50%、70%、80%、90%、95%和100%酒精进行梯度脱水，每浓度梯度浸泡20 min。脱水完毕的样品在1 h内用丙酮冲洗 6次，置换出残余的酒精。用国产环氧树脂618在恒温箱中进行渗透，渗透条件为28℃，72 h。将样品移至包埋板用环氧树脂进行包埋，再将包埋板置于烘箱内加热，最终加热温度为50℃，利用超薄切片机(Leica EM-UC6)进行超薄切片(50 nm)，选取完整的切片置于铜网上，利用醋酸铅溶液染色；然后置于透射电镜(JEM-1010)下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 美国白蛾幼虫消化道整体结构

图1 美国白蛾6龄幼虫消化道整体结构Fig.1 The morphology of the 6th instar larval alimentary canal in Hyphantria cunea Drury注：FG，前肠；MG，中肠；HG，后肠；Ph，咽；Oe，食道；Cr，嗉囊；Pr，前胃；SG，丝腺；Mt，马氏管；Py，幽门；IL，回肠；Co，结肠；Re，直肠。Note：FG, foregut; MG, midgut; HG, hindgut; Ph,Pharynx;Oe, oesophagus; Cr, crop; Pr, proventriculus; SG, silk gland; Mt, malpighian tubule; Py, Pylorus; IL, ileum; Co, colon; Re, rectum.

美国白蛾的消化道为淡黄色，整体呈管状，分为前肠、中肠、后肠和附属结构(丝腺和马氏管，图1)。马氏管着生于中后肠交界处，附着在中、后肠的外壁上；丝腺共两条，发源于咽，前部较细而后部较粗(图1)。6龄幼虫消化道平均长度为24.703±0.223 mm，其中，前肠最长，平均长度为13.407±0.179 mm，占消化道总长度的54.27%；中肠最短，平均长度5.256±0.058 mm，占消化道总长的21.28%；后肠6.039±0.177 mm，占消化道总长度的24.47%。

2.2 前肠

美国白蛾幼虫前肠分为咽、食道、嗉囊、前胃四部分(图1)，以贲门瓣与中肠分界。扫描电镜(日立S-3400N II)观察表明，其上唇下缘为“W”型，内壁有许多向后的微棘(图2-A)。咽部内壁光滑，食道前部较细，后端渐渐变粗与嗉囊连接(图1和图2-B)，外侧连接处观察到发达的纵肌(图2-B)。嗉囊为食道后的一个膨大结构，外观与前胃相似(图1)，均呈管状，石蜡切片观察表明其外壁的环肌发达，内膜为深褶皱状且表面不光滑(图2-C)。前胃肠壁较薄，外部由纵肌与环肌包裹(图2-D)，内膜观察到爪状棘刺结构(图2-E)，末端着生薄膜状贲门瓣伸向中肠内(图2-F)。

图2 美国白蛾6龄幼虫前肠电镜(A、B、E)、石蜡切片(C、D)和体视镜(F)观察Fig.2 Foregut electron microscope (A, B, E), paraffin section (C, D) and stereoscopic microscope (F) of the 6th instar larvae of Hyphantria cunea Drury注：A，上唇内侧与咽；B，食道与嗉囊交界处；C，嗉囊横切；D，前胃横切；E，前胃内膜；F，贲门瓣。Cm，环肌；In，内膜；L，肠腔；El，肠壁细胞层；Lm，纵肌；Fd，食物；Sp，棘刺；Oe，食道；Ph，咽；Cv，贲门瓣。Note：A, inner side of labrum and pharynx; B, the junction of oesophagus and crop; C, crop trasection; D, proventriculus trasection; E, intima of proventriculus; F, the cardiac valve. Cm, circular muscle; In, intima; L, lumen; El, epithelial layer; Lm, longitudinal muscle; Fd, food; Sp, spinule; Oe, oesophagus; Ph, pharynx; Cv, cardiac valve.

2.3 中肠

中肠位于贲门瓣与幽门瓣之间，整体呈粗细均匀的管状(图1)。石蜡切片显示，中肠的外壁肌肉发达，呈深内褶状，内有一层围食膜(图3-A)。肠壁细胞层发现3种细胞，分别为杯状细胞、柱状细胞与再生细胞(图3-B和图3-G)。消化道腹面中央有两条发达纵肌附着在环肌上(图3-C)，中肠外环肌比嗉囊外壁环肌粗，纵肌紧密贴合在环肌外，有气管附着于外壁肌肉上，通过分支插入肌肉组织内部(图3-D)。中肠内壁观察到密集的刷状绒毛，上面分布着大小不一的囊泡(图3-I和图3-J)。围食膜表面光滑，将食物与上皮细胞隔离开(图3-E)。

馆长被砖子气吞万里如虎的气势说得张口结舌，暗忖那些有鼻子有眼睛的事莫非是假的？可有人反映到文化局了，我是代表局长来找他探口风以期交流的。他娘的，没有就算，关我鸟事啊。

通过组织切片观察发现，在中肠上皮细胞中，柱状细胞与杯状细胞为主要组成部分，呈相间排列(图3-G)，杯状细胞胞壁内侧着生大量微绒毛(图3-G)；再生细胞位于上皮组织底部，细胞核较大，呈游离分布(图3-H)；柱状细胞顶膜上分布着大量微绒毛(图3-I)，在其细胞质内观察到大量粗面内质网、线粒体和囊泡(图3-F)。

2.4 后肠

后肠以幽门与中肠连接，由回肠、结肠和直肠组成(图4-C和图4-D)。幽门外壁为马氏管着生的位置。幽门由幽门锥(图4-D)与幽门瓣(图4-E)构成，幽门瓣内部为发达的瓣状肌肉，外壁为环肌层(图4-A和图4-E)。回肠球状，肠壁薄，外层为单层上皮细胞(图4-B和图4-D)，后端连接结肠。结肠直径比回肠略宽，呈管状，外壁由两层交错的环肌纤维组成，内部包裹着包状突起的膜且膜内壁光滑(图4-F)。直肠较薄，肌肉主要为纵肌且内外各有一层膜包裹(图4-H)。

2.5 附属结构

马氏管呈螺旋状，外壁光滑(图5-B)，共6根，着生于幽门外壁对称着生的柄，然后膨大为囊状结构(图5-A)，称之为膀胱。膀胱另一端向外延伸出一条马氏管，随后分叉为3条。

丝腺共有2条，起源于咽部，前半部分较短而细，后半部分较长且粗，位于消化道两侧(图1，图5-C)。对丝腺的横切观察发现，丝腺由管状膜与内容物构成(图5-D)。

3 结论与讨论

本研究结合了光学显微镜、扫描电子显微镜与透射电子显微镜技术，对美国白蛾6龄幼虫消化道的形态特征进行了研究。美国白蛾幼虫消化道的整体形态为直管状结构，与其它鳞翅目幼虫的消化道结构相似(Sousaetal., 2009; Chen, 2016b; Wangetal., 2018)。

美国白蛾中肠较短，占整个消化道的21.28%，具有吸收、分解食物并代谢有毒物质等作用(Sousaetal., 2009；Wangetal., 2018)。虽然美国白蛾的中肠很短，但对食物仍有较高(38%)的同化率(Schroeder and Malmer, 1980)。共发现了3种上皮细胞，杯状细胞、柱状细胞与再生细胞，其中以柱状细胞与杯状细胞为主，与其它鳞翅目幼虫如大豆夜蛾AnticarsiagemmatalisHübner(Levyetal., 2004)、小蔗螟DiatraeasaccharalisFabricius(Pinheiroetal., 2008)等的中肠上皮细胞种类一致。杯状细胞能够控制钾离子和钙离子的流动，进而控制肠道中的水推动食物流动(Levyetal., 2004)；柱状细胞中的大量线粒体及粗面内质网为柱状细胞产生消化酶及囊泡提供充足的支持，而后消化酶通过胞吐作用被分泌消化酶到中肠，在食物的消化中起着十分重要的作用(Lehane, 1995)，在柱状细胞的顶端观察到大量的微绒毛，这些微绒毛大大增加了肠壁的吸收面积；再生细胞位于上皮组织的底部，数量较少且呈游离分布，它们分裂增殖并一部分分化为柱状细胞以作为消亡后柱状细胞的补充(Sousaetal., 2009)。肠壁内侧有一单层围食膜，围食膜用于包裹住食物，将食物与上皮细胞隔离开，防止上皮细胞受到食物的物理损伤和微生物侵害(Zhongetal., 2013)。

图3 美国白蛾6龄幼虫中肠石蜡切片(A、B)和电镜(C-J)观察Fig.3 Midgut paraffin section (A, B) and electron microscope (C-J) of the 6th instar larvae of Hyphantria cunea Drury注：A，中肠纵切；B，中肠横切；C，中肠腹面；D，中肠外壁肌肉；E，围食膜；F，中肠肠壁结构；G，杯状细胞与柱状细胞；H，再生细胞；I，微绒毛；J，中肠内壁。Mw, 肠壁; Pm, 围食膜; Ep, 上表皮; Cc, 柱状细胞; Gc, 杯状细胞; Rc, 再生细胞; Mt, 马氏管; Lm, 纵肌; Tr, 气管; Cm, 环肌; M, 线粒体; Mi, 微绒毛; Rer, 粗面内质网; Ve, 囊泡; Nu, 细胞核。Note：A，midgut longitudinal section；B，midgut transection；C，the ventral surface of the midgut；D，midgut outer wall；E，peritrophic membrane；F，midgut intestinal wall structure；G，goblet cell and columnar cell；H，regenerative cell；I，microvilli；J，midgut inner wall. Mw, midgut wall; Pm, peritrophic membrane; Ep, epithelium; Cc, columnar cell; Gc, goblet cell; Rc, regenerative cell; Mt, malpighian tubule; Lm, longitudinal muscle; Tr, tracheae; Cm, circular muscle; M, mitochondria; Mi, microvilli; Rer, rough endoplasmic reticulum; Ve, vesicles; Nu, nucleus.

图4 美国白蛾6龄幼虫后肠石蜡切片(A、B)、体视镜(C)和电镜(D-H)观察Fig.4 Hindgut paraffin section (A, B),stereoscopic microscope (C) and electron microscope (D-H) of the 6th instar larvae of Hyphantria cunea Drury注：A，幽门横切；B，回肠横切；C，后肠；D，中后肠连接处；E，幽门瓣；F，结肠外表面；G，结肠内膜；H，直肠横切。Cm, 环肌; Pt, 瓣状肌肉; Mt, 马氏管; El, 肠壁细胞层; MG, 中肠; Co, 结肠; Re, 直肠; PC, 幽门锥; IL, 回肠; Ec, 外膜; In, 内膜。Note：A，pyloric transection；B，ileum transection；C，hindgut；D，the junction of midgut and hindgut；E，pyloric valve；F，colon outer surface；G，colon intima；H，rectal transection. Cm, circular muscle; Pt, petal muscle; Mt, malpighian tubule; El, epithelial layer; MG, midgut; Co, colon; Re, rectum; PC, pyloric cone; IL, ileum; Ec, ectoblast; In, intima.

图5 美国白蛾6龄幼虫马氏管和丝腺扫描电镜观察Fig.5 The malpighian tubule and silk glands electron microscope (A-D) of 6th instar larval of Hyphantria cunea Drury注：A，马氏管起源处；B，马氏管；C，丝腺；D，丝腺横切。BL, 膀胱; Mt, 马氏管; SG, 丝腺。Note：A，the origin of malpighian tubule；B，malpighian tubule；C，silk gland；D，silk gland transection. BL, bladder; Mt, malpighian tubule; SG, silk gland.

后肠是美国白蛾幼虫消化道中最复杂的一部分，分为回肠、结肠和直肠3个部分。其中，幽门前端为幽门锥，壁薄且外壁附着大量纵肌与中肠相连，后端为幽门瓣，幽门瓣由瓣状纵肌构成，控制消化后的食物进入回肠(Baggioetal., 2014)；回肠外观为一球形结构，内壁光滑，其功能是对中肠消化后的食物进行脱水、挤压和下移(崔智芳等，2011)；结肠位于回肠后，表面的环肌组成的肌肉纤维比中肠细的环肌纤维很多(图3-D 和图4-F)。

美国白蛾幼虫的马氏管与其他鳞翅目幼虫的马氏管结构和数量一致，在马氏管的端部与后肠间形成隐肾结构，在水的重吸收方面起着重要作用(程云吉，1998)。同时，马氏管基部的囊状结构将体内代谢产生的尿酸结晶与食物残渣混合，并随肠道排出体外(Gisleietal., 2004)。

研究美国白蛾幼虫消化道的形态与组织结构，有助于进一步探讨其幼虫的食性及系统发育，同时为美国白蛾幼虫消化道的相关功能和消化机理研究提供理论依据。另外，本文仅初步描述了美国白蛾幼虫消化道的形态与组织结构，但美国白蛾幼虫的消化道结构与其消化吸收功能及食性等的关系还有待进一步研究。