利用均匀设计法优化二孢拟奥德蘑母种培养基*

苏楚亮，袁征超，杨昱仪，薛玲娜，卢 意，刘紫荆，刘 然，莫美华

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

二孢拟奥德蘑（Hymenopellis raphanipes）隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌目（Agaricales）膨瑚菌科（Physalacriceae）[1]。郝艳佳等[2]提出一个新的分类中Hymenopellis属为多系类群，其与Protoxerula、粘蘑Mucidula、刺孢Dactylosporina和Ponticulomyces等属均应归并到小奥德蘑属（Oudemansiella）中。目前对二孢拟奥德蘑相关研究较少，国内有其粗多糖的提取及应用等相关研究的报道[3]；国际上对二孢拟奥德蘑的研究还停留在物种鉴定水平，分子及生理活性研究较少，其他学术领域未见报道。通过在前期对二孢拟奥德蘑母种培养基采用单因素优化的基础上，进一步明确培养基中的碳源、氮源、氨基酸、维生素、无机盐等成分含量；通过均匀设计试验研究各成分之间的相互作用，从而获得最佳的母种培养基配方，在为二孢拟奥德蘑的深入研究提供优质菌种的同时，也为二孢拟奥德蘑实现工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

二孢拟奥德蘑（H.raphanipes）（GDMCC No：60886）菌种，原始菌株由莫美华教授及其研究生采自广西省桂林市猫儿山国家自然保护区（N25°52′56.22″，E110°29′32.53″；海拔 1 500 m），由华南农业大学食品学院应用真菌试验室分离、鉴定、保存并提供。

1.2 培养基制备

1.2.1 PDA培养基制备

选取马铃薯200 g，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，纱布过滤，加15 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后于121℃灭菌20 min，取出冷却后贮存备用。

1.2.2 可溶性碳酸钙清液配制

称取10 g可溶性轻质碳酸钙，溶于1 L水中，搅拌溶解静置10 min后取上层清液，添加相应量到试验组中。

1.2.3 氨基酸配制

氨基酸的用量极小，在添加氨基酸的过程中，对于难溶性氨基酸，可用热水溶解稀释到所需浓度，再添加到培养基中[4]。

1.2.4 维生素配制

维生素用量不多，当其以溶液形式存在时，大多数结构不稳定，易受到光和热破坏[5]。因此，应在弱光环境下过滤除菌后现配现用，避免高热和紫外线等外界环境影响，尽量保留其有效活性。

1.3 菌种活化

取出5只二孢拟奥德蘑试管种，分别置于10℃、17℃、24℃的生化培养箱培养1 d，恢复菌种活性[6-7]。后转接至PDA平板培养基，进行菌种活化。从活化菌种中挑选出无污染、菌丝形态健壮、洁白度好的优质菌种平板，采用灭菌打孔器将菌种均匀打成0.5 cm的圆片，供后续试验接种使用[8]。

1.4 均匀设计试验

1.4.1 均匀设计试验方案的制定

根据单因素筛选碳源、氮源、氨基酸、维生素、无机盐的结果，选取淀粉、麦芽浸膏、酵母膏、VB1、天冬氨酸、脯氨酸、硫酸铵、碳酸钙清液、磷酸二氢钾、硫酸镁10个因素作为均匀设计的参试因子，每因子设12个水平，见表1，采用10因素12水平的均匀设计表U12（1210）进行试验设计，见表2，试验方案见表3。按照表3的试验方案配制母种培养基，于121℃灭菌20 min，冷却备用。

表1 参试因素水平表Tab.1 Levels table of test factors

表2 U12（1210）均匀设计表Tab.2Uniform design table of U12（1210）

表3 二孢拟奥德蘑母种培养基优化试验方案Tab.3 Optimization scheme of stock medium of Hymenopellis raphanipes

1.4.2 各组分的添加方式

淀粉、麦芽浸膏、酵母膏、脯氨酸、硫酸铵、碳酸钙清液、磷酸二氢钾、硫酸镁直接添加到培养基中进行高压蒸汽灭菌；VB1、天冬氨酸、脯氨酸3种热敏性的组分通过滤径为0.22 μm无菌脂溶性过滤器过滤添加到培养基中[9]。

1.4.3 接种培养

每组试验方案设置3个重复。将优质菌种平板圆片接种于正中间区域，后倒置于26℃恒温生化培养箱避光培养。

1.5 数据统计与分析方法

所有试验均设计3个重复，采用DPS v9.5数据处理软件进行数据分析和处理。采用Duncan新复极差法进行方差分析。对均匀设计的试验结果使用二次多项式回归分析方法，通过数学模型模拟获得最优配方[10]。

2 结果与分析

2.1 均匀设计试验优化结果

均匀设计试验结果及试验过程中统计的指标洁白度、菌丝密度[11]结果见表4、图1。

表4 二孢奥德蘑母种培养基优化均匀设计试验结果Tab.4 Optimum and uniform design test results for the culture medium of Hymenopellis raphanipes

由表4、图1可知，试验组8的菌丝生长速度最快，试验试剂对菌丝的促生长作用效果明显，同时菌丝洁白度和菌丝密度2个指标的相对值为“最浓密”和“较洁白”，该组试验为直观最优；而试验组12菌丝洁白度和菌丝密度的菌丝生长特征明显，菌丝生长速度也较快，为了进一步验证该试验结果，可以选择试验组8和试验组12作为后续验证试验的试验组。

以表4中数据菌丝生长速度为目标函数（Y），用DPS v9.5对数据进行二次多项式逐步回归分析，所得回归方程为：

对回归方程进行检验，得到复相关系数R=0.999 999，由此可见，菌丝生长速度与回归方程中试验因素的含量有紧密的相关性，其显著性检验值F值=49 999.925 0，显著水平P值=0.003 5＜0.01，剩余标准差SSE=0.000 1，调整相关系数Ra=0.999 989，回归方程极显著，说明方程的可信度较高。方程中各项试验因子的回归系数和t检验结果见表5。

表5 各回归项的回归系数检验Tab.5 Regression coefficient test of each regression item

由表5可知，方程中有X1（淀粉）与X8（碳酸钙清液）、X2（麦芽浸膏）与X8（碳酸钙清液）、X2（麦芽浸膏）与X9（磷酸二氢钾）、X3（酵母膏）与X5（天冬氨酸）、X3（酵母膏）与X6（脯氨酸）、X4（硫酸铵）与X10（硫酸镁）、X6（脯氨酸）与 X10（硫酸镁）共7组的交互作用及X2（麦芽浸膏）、X4（硫酸铵）2因素的平方项P值均显著水平小于0.01，说明他们对菌丝生长速度影响很大，达到极显著水平。样本的观察值、拟合值和拟合误差见表6。

由表6数据显示，观察值与拟合值接近，最大拟合误差绝对值仅为0，进一步说明了回归方程的准确性。

2.2 均匀设计试验结果的验证

通过DPS v9.50进行回归分析，并通过数学模型模拟得到二孢拟奥德蘑母种培养基的理论最优组合试验方案见表7，将其与组间最优配方8、配方12和真菌通用培养基PDA进行对比培养验证试验，结果见表8、图2。

表6 配方的观察值、拟合值和拟合误差Tab.6 Observed value,fitted value and fitted error of the samples

表7 二孢拟奥德蘑优化培养基配方验证试验方案Tab.7 The validation test scheme of the optimum stock medium of Hymenopellis raphanipes

表8 二孢拟奥德蘑优化培养基配方验证试验结果Tab.8 Results of validation test of the optimum stock medium of Hymenopellis raphanipes

由表8、图2可知，在理论最优配方的培养基中，二孢拟奥德蘑菌丝生长速度最快，菌丝密度和洁白度最高；其次为组间最优配方8和配方12，而PDA培养基生长速度最慢，且理论最优与配方8、PDA培养的二孢拟奥德蘑菌丝生长速度存在显著差异，而配方8与配方12、配方12与PDA培养菌丝生长速度无显著差异。因此，二孢拟奥德蘑菌丝生长最适母种培养基为理论最优配方，每升培养基中含淀粉27.50 g、酵母膏5.50 g、硫酸铵1.10 g、天冬氨酸0.02 g，脯氨酸 220.00 μg、VB11.44 μg、可溶性碳酸钙清液11.00 g、磷酸二氢钾10.97 g。

2.3 培养基中硫酸铵（X4）与二孢拟奥德蘑生长速度的关系

通过DPS v9.50对10个参试因子进行单因素变量与生长关系的分析可知，当培养基中添加一定浓度的硫酸铵时，促进菌丝的生长，取其作为单因素试验设计，培养基中硫酸铵浓度（X4）与二孢拟奥德蘑生长速度相关性见图3。

从图3中可以看出，二孢拟奥德蘑的生长与硫酸铵有较强的相关性，硫酸铵浓度在一定范围内，随着添加量的增加能明显促进菌丝生长，表现为较强的正相关关系。在菌丝利用培养基成分的过程中，硫酸铵主要提供游离的NH4+，有利于菌丝直接吸收和转化氮源，进而提高菌丝的生长速度和生物转化率[12]。因此在二孢拟奥德蘑菌丝培育的过程中，可合理添加适量的硫酸铵，有利于培育出优质的菌种。

3 结论

近年来，国内对小奥德蘑属的部分菌株已实现了人工驯化栽培[13]，二孢拟奥德蘑菌株属于新发现的小奥德蘑属真菌，目前对其相关研究较少，通过在前期对母种培养基单因素优化的基础上，进行均匀试验设计优化，从而确定二孢拟奥德蘑最佳的母种培养基配方，为二孢拟奥德蘑的深入研究提供理论依据。据文献报道，小奥德蘑属的大多数种如厚褶小奥德蘑（O.crassifolia）、鳞柄小奥德蘑（O.furfuracea） 等[14-16]可食用，粘小奥德（O.raphanipes）[18]等种甚至可能会成为重要的药用菌种；目前已有的资料表明[3]，二孢拟奥德蘑富含粗多糖，其相关成分具有一定的药理价值。

均匀试验设计的试验结果表明，试验组8和试验组12的二孢拟奥德蘑菌丝生长最佳，菌丝洁白度、菌丝密度指标优良，同时结合DPS v9.50显著性分析，理论最优的的试验配方生长效果显著，远远大于试验组8和试验组12；再结合验证性试验结果，可以明显看出理论最优组配方为最佳配方。因此确定二孢拟奥德蘑母种培养基最佳配方为：每升培养基中含淀粉27.50 g、酵母膏5.50 g、硫酸铵1.10 g，天冬氨酸 0.017 g，脯氨酸 220.00 μg、VB11.44 μg，可溶性碳酸钙清液11.00 g、磷酸二氢钾10.97 g。此外，在二孢拟奥德蘑母种培养基优化的试验因子中，硫酸铵的适量添加能够明显促进菌丝生长，有利于培育优质的二孢拟奥德蘑母种。

与目前大多可商业化栽培的奥德蘑属的母种培养基相比，试验所得的母种培养基配方具有成分明确、碳氮比合适、无机盐成分合理、生长因子添加量适宜等优点[19-20]，避免了母种培育过程中培养基成分的盲目添加，有利于生物转化率的提升和菌丝形态特征等指标的优化，避免菌种传代过程菌种退化现象并促进其优良性状的表达[21]，从而为二孢拟奥德蘑优良菌种的培育提供保障，有利于提高二孢拟奥德蘑出菇时的生物转化率，进而培育出优质的二孢拟奥德蘑子实体，为其商业化栽培提供理论依据。