食用菌活性成分绿色提取方法研究进展*

喻文丽 ，樊永红 **，迪拉热·海米提 ，艾海白尔·卡斯木

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆干旱区生物资源保护与利用实验室，新疆 乌鲁木齐 830046）

全世界至少分布着15 000种大型真菌，有超过2 000种大型真菌被证实可以食用[1]。中国、美国、荷兰、意大利、波兰是世界上栽培、消费食用菌较多的国家。食用菌含有丰富的营养物质，如蛋白质、粗纤维和必需氨基酸等[2]；同时含有大量活性物质，如多糖、黄酮类、萜类、生物碱等[3]。食用菌可以广泛的应用于药物合成，也可作为功能性食品[4]。对于活性成分的提取，常采用溶剂萃取法将食用菌的有效成分萃取出来，主要是借助大量溶剂（一般为水或有机溶剂）将目标成分溶解。操作简单，溶剂易获取，但是对环境污染较大、提取率低、成本高，耗时长[5]。因此近些年国内外出现了许多高效、绿色的提取方法，可替代溶剂萃取法。通过对提取食用菌活性成分的绿色方法进行综述，以对提取方法的发展趋势进行展望。

1 绿色提取方法

1.1 超声波辅助萃取法

超声波辅助提取法主要借助超声波在液体中产生的空化效应、热效应和机械效应，破坏食用菌细胞壁，增加了传质过程，加速反应速率[6]。广泛使用的是酶协同超声波提取法。超声辅助萃取法相比一般提取方法，可克服传统方法的用时长、溶剂用量多的局限性；提取温度低，能完整的保持活性成分；并且工艺耗能低、产量高[7]。

超声波辅助提取法已经被许多研究者广泛应用。利用酶协同超声波方法，在超声功率为340 W，固液比为1∶30，超声时间14 min条件下，香菇多糖得率为14.39%，明显高于水提法的香菇多糖得率[8]。超声波探针的探入增加了固液之间的传质和有效接触面。研究表明，超声波辅助法相比水提法能更有效地从金针菇中提取多糖，并且前者提取的金针菇多糖的抗氧化性更强[9]。超声辅助提取多糖的装置示意图见图1[10]。

另一项研究中，研究了从黑木耳（Auricularia heimuer）中提取多糖的最佳超声波辅助提取条件，发现超声处理功率为350 W，固液比为1∶5，提取时间35 min，提取温度90℃，多糖得率最高。此外，研究了双孢菇（Agaricus bisporus）中提取多糖的最佳参数，结果显示超声处理功率230 W，提取时间62 min，提取温度70℃，多糖得率最高可达6.02%，且提取的多糖具有良好的抗氧化活性，如在浓度为250 μg·mL-1时，双孢菇多糖与对照相比具有更高的自由基清除活性[11]。灵芝在不同提取处理下的电镜细胞结构[12]见图2。

由图2所示，图A是灵芝未经任何处理下的电镜图，细胞壁与内容物的结构都非常完整、紧实。图B和图D是经过索氏提取和热水提取的灵芝电镜图，其结构有轻微改变。图C是经过超声波处理后的灵芝电镜图，细胞基质已经完全改变，结构发生了剧烈变化[13]。超声波辅助提取法通过破坏灵芝等食用菌的组织结构，提高活性成分的传质率，增加了活性成分的提取率。

1.2 超高压辅助萃取法

超高压辅助萃取法是近些年发展较快的一种新型技术，可用于提高食用菌中活性成分的提取率，一方面高压可迅速破坏细胞结构，另一方面可加快传质[13]。萃取溶剂在超高压下迅速渗透到食用菌细胞中，造成细胞体积变化，打破化学平衡，促进细胞移动。在几秒钟内完成减压，细胞的压力从高压迅速降到大气压，在反方向压力作用下，细胞壁和细胞膜受到强烈的冲击变形，压力越大，细胞的渗透性越强。活性成分的溶解度随着压力的增加而增大，随着越多的萃取溶剂进入细胞，溶解在细胞内的活性成分在高渗透压下迅速转移到细胞外实现高效提取。超高压辅助萃取主要由高压系统和样本腔组成[14]，原理见图3。

由图3所示，超高压辅助萃取法处理食用菌的温度一般较低，可以提取不耐热的活性成分，效率高，能耗低。超高压辅助萃取法可有效破坏细胞结构，减少传质阻力，香菇（Lentinus edodes）子实体通过一般破碎均质法（对照）和超高压辅助萃取法试验提取香菇多糖。不同提取方法香菇细胞结构电镜图见图4。

由图4可知，对照组的细胞结构有一定的损伤，但是细胞结构未被完全破坏，有较大颗粒存在，而试验组中已观察不到大颗粒，同时很难观察到细胞结构，细胞破碎的较彻底[15]。研究发现，蛹虫草（Cordyceps militaris）多糖采用超高压萃取法后，多糖率可显著提高，当压力为424 MPa，保压时间5.18 min，提取温度为43.5℃时，蛹虫草多糖得率可达到14.89%[16]。当提取时间为4 min，压力为350 MPa，料液比为1∶35，提取温度为55℃的条件下，香菇多糖提取率为8.96%，此法比水提法和超声波酶解法的提取率都高[17]。

1.3 超临界流体萃取法

超临界流体是高于其温度和压力临界点的物质，不存在明显的液相和气相。超临界流体萃取法的基本特征是随着流体压力和温度的改变，其密度即会改变，一些流体性质在气体性质和液体性质之间。因超临界流体的性质，更有利于提取细胞内化合物[18]。超临界流体萃取法是借助超临界流体介于2种状态之间的性质，从固体和液体中获得活性成分的现代技术，可高效地将目标成分从多种液体、固体或者混合物中提取。传统的溶剂萃取是溶剂扩散到食用菌组织中，通过萃取溶剂将有效成分溶解出来。而超临界流体在萃取时与材料之间不存在表面张力且粘度低于液体，因此流体扩散起来更快，萃取效率更高。对于相同的萃取过程，有机溶剂萃取需要几个小时，而超临界流体萃取法只需10 min～60 min[19]。超临界流体萃取装置[20]见图5。

由图5可知，超临界流体萃取装置包括二氧化碳泵、改性泵、萃取池、分流池和阀门。在操作中，流体（通常是二氧化碳）被加热到超临界状态，然后迅速扩散到物料内部，溶解萃取容器中的目标活性成分。溶解的活性成分在低压分离器中被分离出来，萃取后的超临界流体可以被冷却，再压缩和回收或排放到大气中。乙烷、丁烷、戊烷、一氧化二氮、氨、三氟甲烷和水都可用作超临界流体，但二氧化碳常作为在提取有效成分时的超临界流体。因为二氧化碳是一种不活泼的气体，易制取、价格低、萃取过程不发生化学反应且提取的有效成分纯度更高。该方法可在室温下操作，防止热敏物质的氧化及逸散。二氧化碳仅使用于萃取非极性化合物，萃取极性分子时必须向超临界流体中加入乙醇或甲醇等极性溶剂，萃取成功的关键在于极性溶剂的选择。研究表明提取香菇活性成分时，以乙醇为辅助溶剂和纯二氧化碳为萃取剂的超临界流体萃取得率分别为3.81%和1.01%，且只有超临界流体提取物对黄体微球菌和蜡样芽孢杆菌有抗菌活性[21]。研究发现联合采用水提法、超临界二氧化碳萃取法和热水浸提法可从香菇中提取到麦角甾醇和其他类脂分子[22]。

1.4 微波辅助提取法

微波辅助提取法是一种快速、高效的提取方法，借助微波的均匀辐射加热溶剂和样品，促进目标组分的提取。微波是波长位于1 mm～1 m区间，频率在300 MHz～300 GHz之间的非电离电磁波，在电磁波谱中位于X射线和红外线之间[23]。传统的热萃取法是将能量通过热传导和热辐射的方式，以无选择、无规则的方式传递给萃取剂，萃取剂再将能量传递给基体物质，从基体中得到有效成分，因此萃取效率较低。而微波可以渗透到食用菌组织中，并与极性成分相互作用产生热量。微波能的加热通过离子传导和偶极子旋转直接作用于分子，由于动能增加以及离子的连续运动和方向变化而引起离子之间的摩擦，使离子产生热效应。此过程中氢键遭到破坏，溶剂能更有效地渗透到食用菌基质中。此外，基于不同的介电常数，微波可选择性地加热目标组分[24]。样品的介电常数和介电损耗决定了微波的加热效应，所含组分的微波吸收特性主导了不同物质的微波吸收能力。较高的辐射功率能够提高样品和萃取溶剂混合温度，增加加热效应。因此，可通过控制微波辐射频率提高萃取效率，或通过控制微波辐射功率萃取某一特定组分。此方法具有提取时间短、溶剂用量少、耗能低、工艺简单、无污染等优点。微波辅助萃取装置[25]见图6。

有研究发现，用微波提取食用菌的DNA进行后续的PCR扩增时，只需少量的原始材料，并且几分钟就可完成，而传统的方法需要大量工作，较多原始材料，数小时才能够完成，且在扩增过程中需要用到昂贵且污染环境的化学物质用于细胞裂解和DNA纯化，且微波辅助提取技术可靠性高（90%），适用于新鲜或陈化的真菌培养菌丝体[26]。微波辅助提取方法还可从双孢菇中分离麦角甾醇，此法与传统溶剂提取法相当，但是更简单、快速、高效、经济[27]。

大量研究表明，应用微波辅助提取法从食用菌中提取活性成分的得率与纯度都较高[28]。通过正交优化后确定在微波时间4 min，功率640 W，液比1∶30，浸提2 h的条件下，双孢菇多糖提取率能达到4.11%[29]。微波功率744.8W，微波时间4.2 min，料液比为1.0∶31.1时，蛹虫草多糖得率可达到最高[30]。

为了更有效地在低温高压下萃取材料的活性成分，开发了“超声-微波”协同萃取的方法，将2种方法的优势充分结合。超声波和微波可破坏细胞壁结构，使溶剂快速进入细胞，有效缩短萃取时间，提高萃取率。此外，该工艺有利于提取极性差、热稳定性差的组分，避免了在高温高压下长时间提取而引起的分解，使萃取物的分子结构不被破坏。以灵芝为原料提取多糖，超声功率50 W，微波功率284 W，提取时间701 s，料液比1.0∶11.6是最佳提取条件，此方法与传统的热水提取法相比，多糖的得率明显提高，接近100%，比超声辅助提取法提高了27.7%[31]。

1.5 高压脉冲电场辅助萃取法

近几年，高压脉冲电场已被证实是食用菌提取活性物质很有前景的非热处理提取技术，利用细胞膜电穿孔原理，短时间内对细胞壁和细胞膜造成破坏，致使细胞破壁[32]。典型的脉冲电场系统[20]见图7。

由图7可知，高压脉冲电场辅助萃取装置主要由脉冲发生器、处理室和处理产品的泵送系统组成，由示波器和计算机控制并监控。材料的理化性质和提取条件决定了高压脉冲电场辅助提取的效果，而材料的理化性质主要是类型和细胞大小决定，提取条件一般是温度、pH、电导率和粘度的选择。在萃取的过程中，电场强度、脉冲宽度、处理时间直接影响萃取效果，而脉冲数和能量密度会间接影响萃取效果[33]。

高压脉冲电场技术已经广泛地用于从食用菌中提取活性化合物，从桦褐孔菌中提取多糖时，采用最佳的高压脉冲电场条件，场强为30 kV·cm-1、脉冲数为6、料液比为1∶25、pH 10，多糖的提取率达49.8%，是热碱提取的1.67倍，萃取时间短，萃取效率高且萃取物中的杂质较少[34]。高压脉冲电场技术能显著提高西藏灵芝的胞外多糖（EPS）提取率，在脉冲数为8，电场强度为40 kV·cm-1和pH为7的条件下，EPS的提取率提高了84.3%[35]。从木耳中提取真菌多糖，采用了高压脉冲电场，超声和微波辅助方法，优化提取条件，发现高压脉冲电场的提取率最高[36]。高压脉冲电场技术是一种有效的提取方法，通过控制高压脉冲电场技术的处理条件，可以提高活性成分在不同材料中的溶解速度，提取率高，室温下提取天然活性成分，分子结构不易被破坏。

2 绿色方法的前景和局限

大量的研究结果表明，超声波辅助萃取法、超高压辅助萃取法、超临界流体萃取法、微波辅助萃取法以及高压脉冲电场辅助萃取法都可快速、有效地萃取出食用菌中的活性成分，这些方法与传统方法相比具有一定的优势，但是各种方法也存在不足。各种方法的特点见表1。

表1 食用菌活性成分的提取方法比较Tab.1 Comparison of extraction methods of active components from edible fungi

由表1所示，不同食用菌活性成分相较传统提取法有5个特点。

1）超声波辅助萃取法与传统萃取法相比，几乎不污染环境，此方法可以单独使用也可以与其他方法协同使用；不足之处是超声波作用的有效区域为环形，会受到超声波衰减因素的制约，当提取容器过大时，会形成超声空白区；另外，变幅杆（超声探头）密封在隔音箱中，提取容器使提取量受到很大制约。

2）超高压辅助萃取法破坏细胞结构，增加目标成分与溶剂的接触面积，降低传质阻力，使活性成分迅速溶解，显著地提高了萃取效率。但将这项技术推广到大规模工业化还需一些改进，如设备应加以创新，安装实时温度检测设备；将此技术与其他技术（均质化、酶辅助）协同发展。

3）超临界流体萃取法能够与气相色谱和质谱等技术联用，成为高效的分析手段[37]。超临界流体设备造价较高，因此设备折旧费大大增加了提取成本。

4）微波辅助萃取法不能提取热不稳定的成分；目标成分与溶剂的极性对萃取效果影响大，并且不能提取非极性的成分。

5）高压脉冲电场辅助萃取法能够具有选择性的释放细胞内的可溶性物质，能够获得高纯度成分，设备通用性比超临界流体萃取的高[38]。然而，在大规模工业化中仍会限制其发展，主要是工业中较高的安装成本；萃取效果取决于样品的导电率，因此需要预处理（洗涤、离心等），从而加大了成本的投入[39]。

3 结语及展望

从食用菌中提取活性成分的绿色方法，主要包括超声波辅助萃取法、超高压辅助萃取法、超临界流体萃取法、微波辅助萃取法以及高压脉冲电场辅助萃取法。这些方法可以提高提取率，降低能耗，减少溶剂消耗，并提升提取化合物的质量。但是，部分提取过程复杂，可能会对成分的生物活性产生不利影响。因此，创建一个公共的提取食用菌活性成分的数据库，包括提取活性的方法以及精确的提取条件，可为研究者提供参考和依据。其次，部分提取设备造价过高，不适合中小企业的投产，在保证提取效果的情况下，应探索降低成本的途径。今后的提取方法发展不仅要绿色，还要向低成本工艺方向发展，为今后食用菌有效活性成份的提取提供更多选择。