国兰组培中外植体高效消毒方法分析

罗尚华

[摘要]国兰是所有兰属植物中观赏价值较高的一种植物，该种属包含有蕙兰、春兰、春剑等。国兰素有花中君子的美称，兰花整体呈现出花色淡雅、香味清幽的特点，无论是在文化价值方面还是经济价值方面都有着不俗的表现。组培技术作为为国兰快速繁殖的主要技术，对于提高兰花繁殖速度有着十分重要的作用。本文主要探究了国兰组培中外植体高效消毒方法，希望能对兰花组培技术人员有所参考。

[关键词]国兰;消毒方法;组织培养;外植体;分析

[中图分类号]S663.4

[文献标识码]A

一般情况下，国兰在自然条件下的萌芽率较低，并且都是通过分株的方式进行繁殖。兰花在生长过程中每年产生的新芽较少，导致分株繁殖系数难以提高，根本无法满足当前我国市场对兰花的需求。基于此，种植人员采用组培技术使得兰花得以快速繁殖，提高兰花的繁殖速率，使其能够满足当前市场需求。目前我国国兰组培工作已经实现了产业化发展，这一手段大大缩短了国兰的生长周期。但是根据培育活动的实际情况来看，其中存在有玻璃化、外植体污染等现象，往往导致国兰组培工作难以成功，不利于国兰健康生长。

1 材料与方法

本文研究以某地区国兰不同部位外植体作为实验材料，在对这些外植体进行培养过程中，通过应用不同消毒方法、消毒时间以及消毒剂，设计了多种消毒方案，研究了国兰的快速繁殖技术。

1.1 试验地点

本次实验选择某地区农业生物辐照工程技术研究中心的组培研究室内开展实验活动。

1.2 试验材料

试验材料有春兰新芽以及蕙兰种子。试验中需要应用到的消毒剂有次氯酸钠、乙醇等物，均通过正常渠道进行选购。

1.2.1 酒精。酒精是外植体培育活动中最常见的消毒剂类型之一，70%-75%的酒精杀菌效果最佳，应用无水酒精或者95%的酒精开展杀毒工作会使得菌体表面的蛋白质快速脱水凝固，最终在菌体表面形成一层干燥膜，这样一来在一定程度上导致酒精的渗入效果大打折扣，无法达到预期的杀菌效果。

1.2.2 升汞。所谓的升汞又常被我们称为氧化汞，该物质能够使得蛋白质变性，最终起到杀死菌体的作用。具体而言，升汞的消毒效果最佳，但是需要注意的是，该物质极易在植物材料上残留，进而导致完成消毒工作后需要应用无菌水开展种子清洗清洗工作，并且升汞对于人畜毒害性较高，完成相关工作后一定要记得有效回收。

1.2.3 次氯酸钠。该物质是一种很好的消毒剂，在应用过程中能够释放出大量的活性氯离子，进而起到杀死菌体的目的，次氯酸钠的消毒能力很强，但是对植物会产生一定的破坏作用，培育人员在应用该物质开展消毒工作时一定要对此引起重视。

1.3 实验方法

通过查阅大量资料，在试验过程中主要选用三种试剂，分别为75%的乙醇、10%的次氯酸钠以及0.1%的升汞，将这三种消毒试剂进行自由组合，设置不同的消毒时间，共组合出六种消毒实验组合，具体情况如下表所示。

在试验活动中，首先将国兰的外植体放置到封闭容器当中，而后将不同的新芽与种子进行消毒，再应用无菌水将试验新芽以及种子冲洗6-8次，完成上述活动之后将已经准备好的新芽与种子接种于培养基当中。该培养基的主要组成内容由活性炭2.0g/L、NAA3.0mg/L以及MS+6-BA1.0mg/L这三种物质构成。将国兰种子当做外植体的过程中，不同的蒴果大概需要接种10瓶，每瓶内的种子大概有500颗。在将国兰的新芽作为外植体时，每瓶只需要接种一个新芽。完成上述工作之后的15天，统计培植工作中的污染情况。随后将其放置在2000Lx光照强度下，每天光照时间12h进行培养。

1.4 数据处理

在该实验活动中涉及到的所有数据都可以采用MicrosoftExcel软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒劑处理对蕙兰种子的消毒效果

在本次试验活动中，不同消毒剂对蕙兰种子的不同处理结果如下表2所示。

由表2可知，在蕙兰种子组培活动中，采用0.1%升汞的消毒时间分别为3、5、8分钟，在此高效消毒手段过后种子的污染率分别为24%、16%以及12%，由此可知，在应用升泵溶液对蕙兰种子进行消毒时，在灭菌时间不断增加的情况下种子的污染率呈现出逐渐降低的现象，种子培育工作较为理想。在应用l0%次氯酸钠开展消毒工作时，消毒时间分别为10、15、20分钟，消毒后的种子污染率分别为36%、24%、16%，这一现象说明了10%次氯酸钠对于蕙兰种子的消毒效果与0.1%升泵溶液的效果十分类似。两种消毒药剂都会随着时间的增长消毒效果越高，外植体的污染率越低。总的来说，0.1%的升汞相较于10%的次氯酸钠而言，消毒效果更佳。在培育蕙兰种子的过程中，因为种子的萌发时间较长，因此在检查种子污染率时种子往往还未完全萌发，不能测量出种子的死亡率。但是从上述试验结果可知，蕙兰种子在培育过程中，最佳消毒方式为0.1%升汞+75%酒精消毒8min的消毒方式。

2.2 不同消毒剂对春兰新芽的消毒效果

由表3可以看出，应用0.1%升泵对春兰新芽进行处理时，消毒时间分别为3、4、8分钟，最终春兰新芽的污染率为36%、24%、16%，产生的新芽数为2、3、1，这一现象说明了在种子培育阶段，应用0.1%升泵溶液开展处理工作时，随着时间的延长，消毒处理的效果越好。但是结合实际种植情况来看，长时间的利用升汞溶液对蕙兰种子进行处理，极易导致蕙兰新芽死亡，出现这一问题的根本原因在于升汞的毒性较大，长时间的消毒处理容易使得外植体死亡。在应用10%的次氯酸钠开展消毒工作时，消毒时间分别为10、15、20分钟，春兰新芽在此情况下最终污染率为48%、28%、24%。由上述结果可知，应用10%次氯酸钠在对春兰新芽进行消毒处理时，效果与0.1%升汞溶液十分相似，在实际操作过程中，消毒时间的增加会使得新芽的污染率逐渐下降。对试验活动进行全面观察可以发现，春兰新芽在次氯酸钠消毒情况下，生长情况不是特别理想，出现此类现象的主要原因在于新芽的细胞分裂素以及生长激素浓度不合适导致。总的来说，在对春兰新芽进行处理时，最好的消毒方式为0.1%升汞+75%酒精消毒5min效果最佳，最终能够获得良好的春兰新芽组培灭菌效果。

3 结论与讨论

在开展国兰培育工作时面临的主要问题便是外植体的污染问题，一般情况下污染现象包含有病毒、细菌等微生物污染现象，这也是兰花培育工作中影响出苗的重要指标之一。在兰花组培活动中，通常污染现象都是细菌污染。导致污染的原因有外植体材料污染、培养基污染、接种员工违反相关操作规定等等，这些都是导致兰花组培活动发生污染现象的主要因素。细菌污染可以分为外生污染与内生污染两种，外生污染可能是因为器具消毒不彻底等，发生内生污染的主要原因可能是因为外植体本身携带细菌导致，基于此，在组培活动中选择合适的外植体材料，采取合理的灭菌手段尤为重要。

目前在我国，针对兰花组培活动的研究较多，不少专业人士将国兰的茎尖、根尖部分作为组培外植体开展组培工作，利用消毒剂对其进行处理。根据笔者的试验结果来看，在培育蕙兰种子的过程中，应用75%乙醇45s+0.1%升汞消毒8min的效果最佳，在培育春兰新芽的过程中，应用75%乙醇45s+0.1%升汞消毒5min的灭菌效果最佳。具体来看，不同的外植体耐消毒剂的能力有所不同。基于此，种植人员在培育国兰的过程中，要结合实际情况，采取科学合理的培育手段，以提高外植体的成活概率。除此之外，相关实验研究结果还表明，应用升汞消毒的效果优于次氯酸钠，但是在此过程中培育人员需要严格掌握消毒时间，切记不能消毒过度，以免导致外植体出现死亡现象。此外，还需要应用乙醇对外植体进行温和处理，以便能够减少国兰外植体的死亡现象。

在国兰组织培养过程中，外植体受污染的概率较高，工作人员如何在培育工作中降低外植体的污染概率是培育工作主要面临的问题。在此过程中，工作人员首先要选择合适的杀菌剂，掌握正确的消毒方法。其次还需要在各个环节的培育工作中规范自身操作行為，杜绝各类污染现象的产生。例如在对国兰外植体培育活动中应用到的培养器皿进行消毒时，要合理增加培养器皿的高压灭菌时间。在选择外植体的过程中要尽量选择无任何病虫害、洁净的外植体。在外植体接种工作中，一定要严格按照各个操作流程进行操作，在外植体的培养基中可以适当地添加滤杀菌后的抗生素，以便能够有效降低外植体的污染率。

4 结语

综上所述，相关人员在开展国兰培育工作时，为了有效提高国兰外植体的生存率，工作人员首先要选择质量较优的外植体，随后合理选择实验活动中应用到的消毒剂，避免对外植体造成损害，探究出符合外植体发育的消毒手段，严格按照各个培育环节的规章制度开展培育工作，为提高国兰培育质量与效率打下坚实的基础。

[参考文献]

[1]于永畅，张安琪，聂硕，等.国兰组织培养中外植体消毒试验研究[J].山东林业科技，2013（05）.

[2]王济红，刘燕，向立容，等.文心兰组培育苗初诱导关键技术研究[J].贵州师范大学学报，2013（02）.