新型铕螯合物的合成及在时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌中的应用

谢东琴，王艳，林鹏*

(1.集美大学 水产学院，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021；2.厦门华厦学院，福建 厦门 361021)

1942年Weissman[1]研究发现了稀土离子螯合物的特殊发光性质，自此之后对稀土离子螯合物的研究一度成为科学界的热点.稀土离子螯合物可作为优良的发光材料，应用于激光技术[2,3]、静电纺丝[4,5]、光纤放大[6-8]、稀土荧光粉[9]、细胞成像[10]以及发光材料[11,12]等的研究.螯合物作为优良的发光材料，其最大的特点是具有较长的荧光寿命，经脉冲激发光照射后，通过仪器的时间分辨功能，延迟一段时间再测量螯合物的荧光强度，可有效避免来自复杂生物样品、试剂和材料的短寿命荧光的干扰，进而极大地提高测定方法的灵敏度.

时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)是一种非放射免疫标记技术，是以抗原与抗体的特异性结合为基础，以发出长寿命荧光的稀土离子螯合物为标记物，结合仪器的时间分辨功能而建立起来的一种免疫分析技术.该法具有无放射性污染、标记物稳定、操作简便、灵敏、特异、安全、可靠等优点[13].作为最灵敏的生物检测技术之一，TRFIA在临床诊断和生物技术中具有广泛的应用[14-20]，DELFIA体系是TRFIA法中的经典，该体系所用荧光标记物本身的荧光强度较弱，免疫反应发生后，需要引入解离增强液使得稀土离子与增强液中的配体形成新的强荧光螯合物，再进行荧光的测定，不仅增加了操作步骤，而且极易受到空气中稀土离子的污染.合成出荧光强度高、带有标记基团的固相稀土离子螯合物，可以弥补DELFIA体系的不足之处.

本文在前人研究基础之上，首先合成配体4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉(4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline，BCP)，并将该配体同TTA一起与Eu3+进行螯合，得到新型固相稀土离子螯合物Eu(TTA)3(4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉)(Eu(TTA)34,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline，EuTBCP).用生物素标记兔抗嗜水气单胞菌抗体，EuTBCP标记亲和素，然后采用固相TRFIA法检测嗜水气单胞菌B11，将细菌直接包被在微孔板上，加生物素化抗体，再加SA-BSA-EuTBCP，洗涤后可直接测量固相荧光.将该法用于检测病鳗组织嗜水气单胞菌，新合成的螯合物可用于水产致病菌的检测.

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Victor X4 多标记分析仪(Perkins-Elmer公司)；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪(Thermo Scientific Pierce公司)；Direct-Q3超纯水一体化系统(Merck millipore公司)；6545 Q-TOF LC/MS(美国Agilent科技有限公司)；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Scientific公司).

生物素标记试剂盒(24135)(Thermo Scientific Pierce 公司)；2-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)、二甲亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich公司)；4,7-二苯基-1,10-菲啰啉(上海萨恩化学技术有限公司)；25%戊二醛水溶液(美国Ted Pella公司)；氯磺酸(山东西亚化学工业有限公司)；其它相关试剂均为分析纯.

菌株B11分离于患病的日本鳗鲡，并经Biolog 自动生化鉴定系统(GeneⅢ)鉴定为嗜水气单胞菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2018642.菌株B11接种于固体培养基培养后，采用平板菌落计数法确定浓度，并调整浓度至 1×108cfu/mL备用.用福尔马林灭活菌株制备菌苗，再用该菌苗注射兔获得抗血清，抗血清通过SPA亲和层析柱纯化得到兔抗IgG，ELISA法测得其效价为1∶25600.

1.2 EuTBCP的合成

1.2.1 中间产物BCP的合成

合成路线设计：以4,7-二苯基-1,10-菲啰啉为底物，在高温条件下，和氯磺酸发生氯磺酰化反应，主要反应方程式如图1所示：

图1 4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉合成路线

合成步骤：移取4.0 mL氯磺酸于三口烧瓶中，冰盐浴冷却30 min后，称取4,7-二苯基-1,10-菲啰啉(664.8 mg，2 mmol)，固体加料漏斗分4批以1 min间隔将其加入到氯磺酸中，继续搅拌30 min.油浴缓慢升温至85 ℃，反应进行6 h，薄层色谱(Thin-layer chromatography，TLC)法追踪反应进程，待生成的产物不再增加时停止反应.反应液冷却至室温后，逐滴滴加到170 mL冰水中，边滴加边搅拌，立即有大量白色沉淀生成，真空抽滤，去离子水快速洗至中性，真空干燥10 h，称重，避光保存在-20 ℃.

1.2.2 EuTBCP的合成

合成路线设计：见图2

合成步骤：称取Eu2O3(88.0 mg，0.025 mmol)溶解在1.0 mL浓盐酸中，加热至85 ℃蒸干得水合EuCl3，加入1.5 mL无水乙醇蒸干得EuCl3，再加入3 mL无水乙醇溶解EuCl3.称取BCP(264.5 mg，0.5 mmol)溶于10 mL无水乙醇中，加入EuCl3乙醇溶液，60 ℃搅拌40 min，用NaOH乙醇溶液调节pH至6-7之间.称取TTA(331.5 mg，1.5 mmol)溶于5 mL无水乙醇中，并将其逐滴加入到上述溶液中，60 ℃搅拌回流5 h.冷却，抽滤，用冷的无水乙醇快速洗涤沉淀，真空干燥，得浅粉色固体产物，避光保存在-20 ℃[21].

图2 EuTBCP的合成路线

1.3 生物素化IgG的制备

将抗嗜水气单胞菌B11血清经蛋白A亲和层析法纯化后，冻干，溶于适量磷酸盐缓冲液(PBS)中，用BCA蛋白浓度测定试剂盒确定IgG原液浓度；取出适量IgG原液用PBS稀释到1 mL，浓度为2 mg/mL；称取1.1 mg 试剂盒中的生物素溶于200 μL水中，取出27 μL生物素溶液加入到IgG溶液中，4 ℃搅拌2 h；用试剂盒中的蛋白脱盐柱对生物素化IgG进行纯化.

1.4 亲和素的EuTBCP标记

向0.6 mL的PBS(0.1 mol/L，pH 7.1)加入0.4 mg链霉亲和素(SA)和0.4 mg牛血清白蛋白(BSA)；加入0.1 mL 2.5%戊二醛，4 ℃磁力搅拌24 h；加入0.4 mg NaBH4室温孵育2 h；3 L 0.9% NaCl溶液4 ℃透析24 h，其间换透析液1次；加入10 mg NaHCO3，用1 mol/L NaOH溶液调节pH至9.1；称取1.5 mg EuTBCP溶在40 μL DMSO中，将其分4次以1 min间隔加入到上述溶液中，室温搅拌1 h；4 ℃透析24 h，其间换透析液1次；收集标记物链霉亲和素-牛血清白蛋白-EuTBCP(SA-BSA-EuTBCP)，保存在-20 ℃[22].

1.5 免疫反应体系的建立

用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌B11菌液稀释成不同浓度，每孔100 μL加入到96孔微孔板中，60 ℃包被12 h；每孔加入300 μL洗涤缓冲液洗板3次，每次3 min；加入200 μL BSA封闭液，37 ℃封闭2 h；洗涤3次，加入1∶200稀释的生物素化IgG溶液100 μL，37 ℃震育90 min；洗涤3次，加入1∶200稀释的SA-BSA-EuTBCP溶液100 μL，37 ℃震育90 min；洗涤6次，测量固相荧光.

2 结果与讨论

2.1 高分辨率质谱

图3为产物EuTBCP(分子式：EuC48H29N2F9Cl2S5O10)的高分辨率质谱图.该物质的M++H为1347.88 cm-1，目标峰向右的峰依次是在前一个峰的基础上加一个氢原子的峰.

图3 EuTBCP质谱图

图4 EuTBCP红外光谱图

2.2 红外光谱

2.3 螯合物荧光性能

图5给出了浓度为1×10-5mol/L EuTBCP在DMSO中的时间分辨荧光激发和发射光谱，测定所用仪器为Varioskan Flash全波长多功能酶标仪，测定条件为：延迟时间0.2 ms，激发狭缝12 nm，发射狭缝2 nm，积分时间1 ms，测量时间100 ms.

EuTBCP的荧光衰减曲线如图6所示，测定所用仪器为Varioskan Flash全波长多功能酶标仪，测定条件为：激发波长352 nm，发射波长614 nm，激发带宽12 nm，测量时间100 ms，积分时间0.1 ms.图7为EuTBCP荧光衰减曲线及其拟合曲线，拟合曲线方程为y=314000e-0.003x，R2= 0.9997.螯合物荧光寿命870 μs.

图5 EuTBCP时间分辨荧光激发和发射光谱

图6 EuTBCP荧光衰减曲线

图7 EuTBCP荧光衰减曲线及其拟合曲线

图8 新型螯合物TRFIA法标准曲线

2.4 工作曲线及检测限

利用1.5建立的新型螯合物TRFIA法检测嗜水气单胞菌B11，结果见图8，标准曲线方程为lg TRF=0.0838 lg CFU+2.8081，R2=0.9868，线性范围为1×105-1×108cfu/mL，检测限1×105cfu/mL.

2.5 特异性实验

利用建立的新型螯合物TRFIA法对菌株B11以及其他10株水产致病菌株进行交叉因素的测定.结果如表1所示，结果表明抗嗜水气单胞菌抗体与菌株B11有较强的阳性反应，与其他菌株均无明显交叉反应.表明建立的新型螯合物TRFIA法可以用于嗜水气单胞菌的免疫检测.

表1 新型螯合物TRFIA特异性测定

2.6 日本鳗鲡实际样品检测

利用新型螯合物TRFIA法对20份鳗鲡组织(肝、肾、鳃、肠、肌肉)样品进行嗜水气单胞菌的检测，对照组以无菌生理盐水代替组织样品.结果见表2，有15份样品呈阳性结果，阳性检出率为75%，这说明新型螯合物TRFIA法可用于带病鳗鲡的早期诊断.

表2 新型螯合物TRFIA法检测日本鳗鲡组织样品结果

3 结 论

设计合成了一种新型氯磺酰化的邻菲啰啉衍生物配体，使用高分辨率质谱和红外光谱对其结构进行鉴定，结果表明确系目标产物4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉，并将该配体同TTA一起与Eu3+进行螯合，得到新型固相稀土离子螯合物EuTBCP，荧光寿命长达870 μs，对螯合物进行时间分辨荧光光谱扫描，得到其激发波长和发射波长分别为352 nm和614 nm.

EuTBCP的氯磺酰基可以直接和蛋白质连接，无需解离本身就可产生很强的长寿命荧光，具有一定的潜在应用价值.将EuTBCP应用于嗜水气单胞菌的免疫检测中，利用建立的新型螯合物直接TRFIA法检测嗜水气单胞菌B11，对20份患病鳗鲡样品的检测，结果表明该方法可用于水产致病菌的检测.