基于溶菌酶释放蛋白的猪链球菌间接ELISA 抗体检测方法的建立

乔 宏，龚 俊，栾 慧，李 刚，刘思国，王春来

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，可导致患病猪出现败血症、脑膜炎、关节炎、突然死亡等病症[1-2]。同时，SS 也是一种重要的人兽共患病病原菌。江苏省1998 年暴发的猪链球菌2 型（SS2）疾病造成了大量猪死亡[3]；四川省2005 年暴发的SS2 疾病共导致了38 人死亡[4]。根据SS 荚膜多糖抗原成分的差异可将其分为33 个血清型（1～31 型、33 型、 1/2 型），但之后，20、22、26 和33 型被重新划分为其它链球菌属，剩下的29 个血清型被认为是真正的SS[5-8]。其中2 型流行最广且分离率最高[9]，感染了SS2 的病猪在未接受任何治疗的情况下死亡率一般可达到20%[10]，给养猪行业造成了重大的经济损失。此外，SS2 经常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、副猪嗜血杆菌（HPS）和猪圆环病毒（PCV）等发生混合感染[11-13]，给临床诊断及治疗造成了很大困难。因此，建立一种简单、准确并且快速的诊断方法对该病的防治具有非常重要的意义。

溶菌酶释放蛋白（Muramidase-released protein，MRP）基因是在SS2、6 型（SS6）、7 型（SS7）、8 型（SS8）、9 型（SS9）、12 型（SS12）、13 型（SS13）、16型（SS16）以及24 型（SS24）等不同血清型的菌株中高度保守的一个基因，该基因编码的MRP 蛋白含有多个抗原表位，可以刺激机体产生特异性抗体。有研究在分析了近180 株SS2 菌株后发现，从病猪分离的SS2 菌株中有77%为mrp+ef+，分离自病人的SS2菌株中有89%表达MRP，而86%的健康猪分离菌株则为mrp-ef-[14]。表明MRP 与SS 的致病性密切相关。欧瑜等对SS2 HA9801 株mrp基因的298 bp～827 bp 区域的序列进行克隆表达，试验结果表明通过纯化获得的融合蛋白能够被MRP 抗血清识别[15]，表明表达的MRP 蛋白具有较好的反应原性。另有研究以重组MRP 蛋白免疫BALB/C 小鼠，在随后的攻毒实验中有62.5%的小鼠得以存活[16]，表明MRP 蛋白也具有较好的免疫原性。

本研究选取SSmrp基因2 617 bp～3 710 bp 区域的抗原片段经原核表达，并将纯化后的重组MRP蛋白（rMRP）作为包被抗原建立了检测SS2、SS7、SS9 和SS12血清抗体的间接ELISA方法（rMRP-ELISA），以期为SS病的血清流行病学调查提供可靠的技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌株和血清 SS2、SS7、SS9和SS12菌株由本实验室分离保存；HPS、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、多杀巴氏杆菌（PM）、大肠杆菌（E. coli）、以及SS 阴性血清由本实验室保存；猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒（RV）、流行性腹泻病毒（PEDV）、猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）阳性血清及部分SS 阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所相关实验室提供；不同血清型SS 人工免疫阳性血清（SS2、SS7、SS9 和SS12）由南京农业大学和广东动物卫生防治所提供。待检临床猪血清中100 份来自内蒙古某动物疾病诊断中心、240 份来自哈尔滨兽医研究所动物卫生检测中心、另外200 份来自宝士德生物科技有限公司送检的临床猪血清。

1.2 主要试剂 rMRP 为本实验室制备并保存，浓度为0.4 mg/mL；THB 培养基和脱脂乳购自美国BD公司；BamHⅠ、SalⅠ、T4 DNA 连接酶、ExTaqDNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组提取试剂盒、HRP-DAB 增强型底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司；胶回收和质粒微提试剂盒均购自Omega 公司；兔抗猪HRP-IgG 购自Abcam公 司；DNA Maker 购自Coolaber 公司；蛋白Maker 购自赛默公司； NC 膜及Ni-NTA his Bind 亲和树脂购自GE 公司；蛋白预制胶购自金斯瑞（南京）生物技术有限公司。

1.3 rMRP-ELISA 条件优化 通过棋盘法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数。用0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的rMRP 5 倍倍比稀释（0.25 μg/mL、0.05 μg/mL、0.01 μg/mL和0.002 μg/mL），再以100 μL/孔横向加入酶标板，4 ℃包被过夜。将SS2 阳性和阴性猪血清以1 100、1 200、1 300、1 400 稀释后进行方阵试验。每个稀释度阴阳性对照各设2 孔，之后利用酶标仪测定SS2 阳性和阴性血清的OD450nm值，以P/N 值（阳性血清OD450nm/阴性血清OD450nm）最大时的反应条件为最佳工作条件。同样对封闭液（5%鱼皮明胶、5%脱脂乳、5%马血清、5%BSA、1%海藻糖、5%鱼皮明胶+5%马血清、5%脱脂乳+5%鱼皮明胶、5%马血清+0.5%BSA、5%脱脂乳+0.5%BSA 和5%鱼皮明胶+1%海藻糖）及封闭条件（37 ℃2 h、37 ℃过夜、4 ℃2 h 和4 ℃过夜）、待检血清作用时间（0.5 h、1 h、1.5 h 和2 h）、兔抗猪IgG-HRP 稀释倍数（1 5 000、1 10 000、1 15 000 和1 20 000）及作用时间（0.5 h、1 h、1.5 h 和2 h）、底物显色时间（5 min、10 min、15 min、20 min）等条件进行优化。

1.4 临界值的确定 利用优化后的rMRP-ELISA 方法检测背景明确的60 份SS 阴性血清，计算出这60份血清的平均OD450nm值（-X）和标准差（SD），当待检血清平均OD450nm值≥-X+3SD 时判定为阳性，当待检血清平均OD450nm值<-X+3SD 时判定为阴性[17]。

1.5 特异性试验 利用优化之后的rMRP-ELISA 方法检测100 份已知的SS 阴性血清样品，根据检出的阴性血清份数计算该方法的特异性；同时，利用优化之后的rMRP-ELISA 方法，对HPS、APP、PM、E. coli、TGEV、RV、PEDV、PRRSV、SS7、SS9 和SS12 的阳性血清进行检测，并设SS2 阳性血清作为阳性对照，每个样品均设2 个重复。计算待检血清的OD450nm均值，评估其特异性。

1.6 敏感性试验 利用优化之后的rMRP-ELISA 方法，检测50 份已知的SS 阳性血清样品，根据检出的阳性血清份数计算该方法的敏感性；将SS2 阳性血清2 倍倍比稀释（1 50～1 6 400），利用该rMRPELISA 方法检测，每个稀释度及阴阳性对照血清均设2 个重复。测定各血清样品的OD450nm值并计算各待检血清的OD450nm均值，评估该方法的敏感性。

1.7 重复性试验 批内重复性试验：随机选取背景清楚的4 份SS2 阳性血清和2 份SS 阴性血清，利用同一批次制备的rMRP-ELISA 板进行检测，每份血清样品做6 次重复，计算其平均值，并对检测结果进行统计学分析，计算批内变异系数；批间重复性试验：利用不同批次包被的rMRP-ELISA 板对上述4份SS2 阳性血清和2 份SS 阴性血清样品进行检测，每份血清样品做6 次重复，计算其平均值，并对检测结果进行统计学分析，计算批间变异系数。评估该方法的重复性。

1.8 符合率试验 由于目前市售的检测SS血清抗体的ELISA 商品化试剂盒较少，仅有的一种检测效果也不是很理想。所以本研究利用玻片凝集试验对本实验建立的rMRP-ELISA 方法做符合率试验。将在固体平板培养基上培养的12 h～24 h的SS2 05ZYH33株、SS7 ZZ-6-6 株、SS9 GZ-2 株和SS12 GZ-8 株作为标准凝集原，SS2、SS7、SS9、SS12 阳性血清以及SS 阴性血清分别作为阳性对照和阴性对照，且均设2 个重复。

分别利用rMRP-ELISA 和玻片凝集两种方法同时检测100 份来自内蒙古某动物疾病诊断中心的临床猪血清样品抗体并计算二者的符合率。

1.9 临床样品检测 利用本研究建立的rMRP-ELI⁃SA 方法对哈尔滨兽医研究所动物卫生检测中心的240 份临床猪血清以及宝士德生物科技有限公司送检的200 份临床猪血清进行检测，统计血清抗体阳性率。

2 结 果

2.1 rMRP-ELISA 最佳反应条件的确定 采用方阵滴定法优化ELISA 反应条件，以P/N 值最大者为最佳条件，优化结果见表1。

2.2 临界值的确定 利用建立的rMRP-ELISA 方法检测背景明确的60 份SS 阴性血清，经计算这些阴性血清平均OD450nm值为0.193，标准差为0.011，阴阳性临界值=0.193+3×0.011=0.226。当样品OD450nm平均值≥0.226 判定为阳性，当样品OD450nm平均值<0.226 判定为阴性。

表1 rMRP-ELISA 检测方法反应条件的优化结果Table 1 The optimized conditions of the rMRP-ELISA

2.3 特异性试验结果 利用优化之后的rMRP-ELI⁃SA 方法对100 份已知的SS 阴性血清进行检测，检出97 份阴性、3 份阳性血清，因此该方法的特异性为97%；利用本研究建立的ELISA 方法检测HPS、APP、PM、E. coli、TGEV、RV、PEDV 和PRRSV 阳性血清，检测这些阳性血清样品的OD450nm平均值均小于0.226，判定为阴性；而SS7、SS9 和SS12 阳性血清的OD450nm平均值均大于0.226，判定为阳性（表2）。表明本研究建立的ELISA 方法具有较强的特异性。

2.4 敏感性试验结果 利用优化之后的rMRP-ELI⁃SA 方法对50 份已知的SS 阳性血清进行检测，检出48 份阳性、2 份阴性血清，因此该方法的敏感性为96%；同时，利用本研究建立的ELISA 方法对1 50～1 6 400 稀释的SS2 阳性血清进行检测。结果显示，当血清稀释度为1 3 200时，其结果仍为阳性（表3），表明该方法具有较高的敏感性。

表2 特异性试验结果Table 2 Specificity test results

表3 敏感性试验结果Table 3 Sensitivity test

2.5 重复性试验结果 将不同抗体水平的4 份SS2阳性血清和2 份SS 阴性血清进行批内和批间重复性试验，经计算结果显示，批内变异系数为2.87%～4.70%，批间变异系数为3.10%～7.20%。均小于10%（表4），表明该方法具有较好的重复性。

2.6 符合率试验结果 分别采用玻片凝集方法和rMRP-ELISA方法同时检测100份内蒙古某动物疾病诊断中心临床猪血清样本。凝集试验结果显示，SS2、SS7、SS9、SS12 阳性血清均为阳性结果，而SS 阴性血清和空白对照的试验结果均为阴性结果。玻片凝集试验的阳性对照和阴性对照均成立。玻片凝集试验的检测结果显示，从100 份临床血清样品中检出29 份阳性血清，总检出率为29%；而经rMRP-ELISA方法检测出阳性血清样品34份，总检出率为34%，二者总符合率为85.3%。

表4 rMRP-ELISA 方法的重复性试验结果Table 4 Intra- and inter-batch repeatability test of rMRP-ELISA

2.7 间接ELISA 抗体检测方法的应用 利用本研究建立的rMRP-ELISA 方法对哈尔滨兽医研究所动物卫生检测中心保存的来自东北三省部分地区猪场的240 份临床猪血清以及宝士德生物科技有限公司送检的200 份临床猪血清进行检测，结果显示，SS 阳性检出率为27.7%（122/440）。表明，东北三省部分地区猪场SS 阳性率较高。

3 讨 论

近几年，关于猪链球菌病的ELISA 诊断方法多有报道，由于SS2 在SS 的所有血清型中致病性最强且分离率最高，大多数报道的均是基于SS2 的ELI⁃SA 检测方法。张玲妮等利用SS2 9801 株以及该菌的荚膜多糖（CPS）提取物分别建立了两种间接ELISA方法，对这两种方法的比较结果显示，利用CPS 包被的间接ELISA 方法虽然具有较强的特异性，但是灵敏性较低，同时对ELISA 板的要求较高；而利用全菌包被的间接ELISA 方法，虽然与前者相比特异性较差，但是通过该方法可以找到一个特异性和灵敏度均较高的血清抗体稀释度，因此利用全菌包被的间接ELISA 方法更适合于SS2 血清抗体的检测[18]。高地等建立了SS2 免疫磁珠夹心ELISA 检测方法，结果表明该方法具有较好的特异性和敏感性。但该方法所用磁珠必须要求彻底的活化和淬灭，对磁珠要求较高。另外，在检测过程中可能因为抗体纯度不够或者磁珠上的基团易与二抗发生偶联从而使阴性本底增高，同时磁珠包被抗体之后有效存放时间较短，因此不太适合商品化检测要求[19]。周明光等利用SS2 菌株的CPS 作为包被抗原建立了检测SS2 血清抗体的间接ELISA 方法，结果表明该方法具有操作简单、特异性及灵敏度高等特点，适用于SS2 血清抗体的检测及流行病学调查。利用该方法对来自北京、河南、广东等地的3 991份临床血清进行了检测，结果表明各省临床血清的阳性率在0～41.6%[20]。

本实验建立的rMRP-ELISA 方法具有较强的特异性和较高的敏感性，而且批内和批间重复性试验的变异系数均较低，表明该方法具有较好的稳定性和重复性，并且一抗和二抗的孵育时间较短（30 min）。对送检的440 份临床血清样品的阳性检出率为27.7%，与上述周明光建立的间接ELISA 方法对临床血清样品的检测结果相符。此外，除SS2 之外，其他几种血清型如：SS7、SS9 以及SS12 等也是临床上常见的致病菌，同样危害着猪的健康。而本实验建立的rM⁃RP-ELISA 方法对SS2、SS7、SS9 和SS12 阳性血清的检测结果均为阳性，表明该方法同时适用于SS2、SS7、SS9 以及SS12 血清抗体的检测。因此该间接ELISA 方法可以对SS 进行更加广泛的检测，并且也为SS 病的流行病学调查提供了一种可靠的诊断方法。由于目前本实验室除了SS2、SS7、SS9 以及SS12之外，暂时还没有其它血清型的阳性血清，本实验建立的rMRP-ELISA 方法是否适用于其它血清型SS血清抗体的检测还需要后续试验进一步验证。