表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90 蛋白的重组马立克氏病病毒的构建及生物学特性分析

许曾焜，李 凯，刘永振，高 立，刘长军，张艳萍，高玉龙，祁小乐，崔红玉，王笑梅

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病研究创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

禽网状内皮组织增生病（Reticuloendotheliosis，RE）是由RE 病毒（REV）群的反转录病毒引起的鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一群病理综合征，包括急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征和淋巴组织与其他组织慢性肿瘤[1-2]。流行病学调查研究显示，REV 在我国的流行与分布十分广泛[3-5]。REV 感染后造成机体免疫抑制，影响其他疫苗的免疫效果，并致使感染鸡易于继发细菌和其它病毒感染，给我国养禽业造成了严重的经济损失[6-7]。REV 在现地养殖过程中，也常与其它禽免疫抑制性病毒以及禽肿瘤病毒（例如鸡马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病病毒和禽白血病病毒等）发生混合感染[8-9]。多种病毒混合感染常发生协同致病作用，使得上述疫病防控难度进一步增加。

疫苗免疫是防控动物疫病的主要手段。然而，目前国内外尚无有效的商品化疫苗用于RE 的预防。REV 在感染过程中能够整合入宿主细胞基因组中，导致其在鸡群中垂直传播。传统全病毒弱毒活疫苗的使用将带来一定的安全隐患，并存在毒力返强的风险。REV 编码的gp90 蛋白是病毒的保护性抗原，可以诱导机体中和抗体的产生[10]。基于该病毒gp90 蛋白构建的基因工程疫苗由于不含全病毒，因此在安全性方面优势突出，是研制RE 疫苗的一种理想选择。鸡马立克氏病病毒（MDV）作为一种疱疹病毒，基因组较大且其基因组中含有多个可供外源基因插入的复制非必需区，是研制重组活载体疫苗的理想载体[11]。本研究将REV 的保护性抗原基因gp90 表达框架插入血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因组的US2 基因内部，构建了表达REV gp90 蛋白的重组MDV，并对构建的重组病毒r814-gp90 进行了生物学特性的研究，为RE 重组MDV 活载体疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞和病毒 pCAGGS 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存；pENTR1 载体、克隆有REV HLJR0901 株gp90 基因的重组质粒pUC57-gp90、 克隆有Kan/ccdB 基因的重组粘粒p814-5US2KanccdB、克隆有血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因组的5 个重组粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病研究创新团队构建并保存。大肠杆菌EPI300 株购自EPICENTRE 公司；鸡胚成纤维细胞（CEF）由9～10 月龄SPF 鸡胚制备。血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病研究创新团队鉴定并保存。

1.2 主要试剂 常规PCR 反应酶、限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa 公司；Gateway®LR ClonaseTMII Enzyme Mix 和磷酸钙转染试剂盒，均购自Invitrogen公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN 公司；细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞培养基及胎牛血清购自Gibco 公司；二甲基亚砜（DMSO）购自BioFroxx 公司；鼠抗兔IgG-FITC、IRDye-800 标记的羊抗兔IgG，购自Licor 公司；gp90 单克隆抗体（MAb）由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病研究创新团队制备并保存。

1.3 引物的设计与合成 根据REV HLJR0901 株（GQ415646）基因组序列，利用Oligo 7.0 软件设计扩增gp90 基因引物gp90F：5'-GAATTCATGGACTGC CTGACCAACCTG-3'/gp90R：5'-TTTATCGATTCACTT GTGGCGGCCAGCGGT-3'。根据MDV 814 株US2 基因序列（JF742597），设计鉴定重组粘粒及重组病毒引物US2R：5'-AGACATCCAGTCTATTACCTAGTTTTAA C-3'。引物均由吉林省库美生物公司合成。

1.4 gp90 基因重组粘粒的构建与鉴定 以克隆有REV HLJR0901 株gp90 基因的重组质粒pUC57-gp90为模板，利用引物gp90F/gp90R PCR 扩增获得gp90基因。将纯化后的gp90 基因经EcoR I/ClaI 酶切后克隆入pCAGGS 载体，构建重组质粒pCAGGS-gp90。将该重组质粒经SalI/HindIII 酶切后获得gp90 基因表达框架，将其经SalI/HindIII 酶切后克隆入pEN⁃TR1 载体，获得含有gp90 基因表达盒的重组质粒，经测序鉴定正确后命名为pENTR1-gp90。将pEN⁃TR1-gp90 与重组粘粒p814-5US2KanccdB 均稀释至300 ng/μL，按1 1的比例各取1 μL混合，加入2 μL的Gateway LR ClonaseTMII Enzyme Mix 进 行LR 反 应，反应条件为：25 ℃作用1 h，加入1 μL 蛋白酶K，置37 ℃作用10 min 终止反应，将反应产物转化大肠杆菌EPI300 并涂布在氯霉素抗性LB 平板上，37 ℃过夜培养后，提取粘粒，PCR 鉴定构建的重组粘粒所包含的814 株基因组的US2 基因中是否插入gp90 基因表达框架，并对PCR 产物测序鉴定，鉴定正确的重组粘粒命名为p814-5-gp90。

1.5 表达gp90 基因的重组MDV 的拯救 利用试剂盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5-gp90 5 个重组粘粒，通过磷酸钙法将5 个粘粒共转染次代CEF 细胞，4 d～5 d 后，观察转染的细胞是否出现MDV 特异性蚀斑病变。出现蚀斑后在CEF 中连续传20 代，收获第5、10、15、20 代含病毒的细胞。利用试剂盒提取细胞总基因组DNA，同时设亲本病毒814 株基因组DNA 对照，利用引物gp90F/US2R 经PCR 鉴定，并测序鉴定。鉴定正确的重组病毒命名为r814-gp90。

1.6 重组MDV gp90 蛋白表达的检测 将第20 代重组病毒r814-gp90 株与亲本病毒814 株分别接种CEF，培养4 d～5 d 后经显微镜观察，比较病毒在感染细胞中产生的蚀斑，并以gp90 蛋白MAb（1 100）作为一抗，以鼠抗兔IgG-FITC（1 200）作为二抗，采用间接免疫荧光试验（IFA）鉴定gp90 蛋白的表达。同时，以gp90 蛋白MAb（1 1 000）作为一抗，以IRDye-800 标记的羊抗兔IgG（1 10 000）作为二抗经western blot 鉴定。以上试验均以亲本814 株接种的CEF 作阴性对照。

1.7 重组MDV 生长曲线的测定 将重组病毒r814-gp90 株和亲本病毒814 株分别以100 个蚀斑形成单位（pfu）的剂量接种于48 孔板中的次代CEF，感染后每隔24 h 收集含有病毒的细胞，持续至感染后144 h。将各个时间点所收集的病毒接种CEF，测定各时间点病毒的pfu，绘制生长曲线，分析重组病毒r814-gp90株和亲本病毒814株在CEF中的生长特性。

2 结 果

2.1 重组粘粒的构建及鉴定结果 将PCR 扩增获得的gp90 基因插入到pCAGGS 载体，构建重组质粒pCAGGS-gp90。通过酶切获得gp90 基因表达盒，并将其克隆至pENTR1 载体，构建重组质粒pENTR1-gp90。通过LR反应，将gp90基因表达盒替换至重组粘粒p814-5KanccdB 中，构建重组粘粒p814-5-gp90。将重组粘粒p814-5-gp90 利用gp90F/US2R 经PCR 鉴定。结果显示，获得的PCR产物长度为1 900 bp（图1），测序结果显示PCR 产物包含gp90 基因和gp90 基因表达盒下游polyA 序列。而阴性对照样品（亲本粘粒p814-5）无gp90 基因插入序列。以上结果表明，重组粘粒p814-5-gp90 正确构建。

图1 重组粘粒p814-5-gp90 的PCR 鉴定结果Fig. 1 Amplification of recombinant fosmid p814-5-gp90 by PCR

2.2 重组MDV r814-gp90 的拯救及PCR 鉴定结果将p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5-gp90重组粘粒共转染次代CEF，转染后10 d 出现MDV 特异性蚀斑病变，初步证明经拯救获得了重组病毒r814-gp90。将拯救获得的重组病毒在CEF 中连续传20 代，提取第5、10、15、20 代r814-gp90 株基因组DNA，利用引物gp90F/US2R 经PCR 鉴定。结果显示，PCR 产物长度为1 900 kb（图2），测序结果显示插入的gp90 基因表达框架序列与预期一致；而亲本疫苗814 株基因组DNA 扩增结果为阴性。表明重组病毒r814-gp90 基因组中插入的gp90 基因序列正确，且其能够稳定存在。

图2 不同代次重组病毒r814-gp90 株的PCR 鉴定结果Fig. 2 Identification of different generation recombinant virus r814-gp90 by PCR

2.3 重组MDV r814-gp90 株的gp90 蛋白表达的鉴定结果 将获得的第20 代重组病毒r814-gp90 株与亲本病毒814 株分别接种CEF，4 d～5 d 后观察比较病毒在感染细胞中产生的蚀斑可见，r814-gp90 株在CEF 中产生折光性增强的圆形细胞，有些变圆细胞连成葡萄串样的蚀斑形态，与亲本病毒814 株无明显差异。利用IFA 检测目的基因gp90 的表达，结果显示，r814-gp90 株感染的细胞可见绿色荧光信号，而亲本病毒814 株以及没有接毒的对照细胞均无荧光（图3）。Western blot 结果显示，r814-gp90 株感染的细胞中可以检测到90 ku 的目的蛋白条带，与预期gp90 蛋白大小相符（图4）。以上结果表明r814-gp90 株可以在感染细胞中表达gp90 蛋白。

图3 重组病毒的IFA 鉴定结果Fig. 3 Identification of recombinant virus by IFA

图4 重组病毒的western blot 鉴定结果Fig. 4 Identification of recombinant virus by western blot

2.4 重组病毒r814-gp90 株生长曲线的测定结果将重组病毒r814-gp90 株和亲本病毒814 株分别以100 pfu 接种CEF，每24 h 收集细胞，利用CEF 测定病毒的PFU，并绘制病毒的生长曲线。结果显示，重组病毒与亲本病毒均在感染后120 h 病毒的滴度达到最高峰，分别为9.15×104pfu/mL 和9.74×104pfu/mL；各时间点r814-gp90 株的滴度与亲本病毒无明显差异（p>0.05）（图5）。表明重组病毒r814-gp90 株在CEF 中的复制特性与亲本病毒一致。

图5 重组病毒在CEF 中生长曲线的测定Fig. 5 Replication kinetics curie of the recombinant virus in CEF

3 讨 论

REV 是感染鸡、鸭、火鸡和其它禽类的一种免疫抑制性和致瘤性反转录病毒[1-2]。目前普遍是采用类似于禽白血病的净化策略来防控RE，然而，在当前现地REV 感染阳性率如此高的情况下进行该病的净化，难度非常大，而且净化成本很高，费时耗力。因此，研制一种安全、有效的疫苗对于RE 的防控具有非常重要的意义。

REV 不仅能够水平传播，还能够通过鸡胚垂直传播，在实际生产中其引起的症状不典型，检测较为困难，容易被忽视，防控RE 有一定难度[12]。本研究将REV 的保护性抗原基因gp90 表达框架插入血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因组中，构建了表达gp90 蛋白的重组MDV r814-gp90。对该重组病毒进行外源蛋白表达、细胞病变以及复制特性分析显示，r814-gp90 可以在CEF 中稳定表达外源蛋白gp90；其在CEF 中产生的蚀斑病变以及复制能力与亲本病毒814 株无显著性差异。以上结果表明，r814-gp90 有望作为一种重组MDV 候选活载体疫苗用于RE 的预防。

近年来的研究表明，REV 的感染在我国具有较为广泛的地理分布。REV 除自身致病外，其还可以引起动物机体的免疫抑制，导致机体对其它疾病的易感性增加，甚至造成免疫失败现象[12]。REV 与其它病毒经常发生混合感染，进一步增加了疾病的防控难度。多项研究显示，REV 与MDV 的混合感染会发生协同致病作用，导致感染鸡肿瘤的发生率升高；REV 与其它病毒的混合感染还会降低MDV 疫苗的免疫效果[9]。814 疫苗株作为一种血清1 型MDV 弱毒疫苗，具有良好的安全性和有效性，本研究采用该株病毒为载体构建了表达REV 保护性抗原gp90 蛋白的重组MDV r814-gp90，也同样有望用于MD 的预防。综上所述，本研究构建的重组MDV 和r814-gp90 有潜力作为一种候选二联疫苗用于RE 与MD 的预防。