基于p38MAPK通路的电针扬刺对大鼠创面修复及血清炎性因子表达的影响

杜伟斌 陈荣良 胡华辉 沈福祥 曹国平 王利祥 全仁夫

【摘要】 目的：探討基于p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路下的电针扬刺法对大鼠创面修复及血清相关炎性因子表达的影响。方法：选择健康SD大鼠30只，将其按随机数字表法分为模型组、电针组和电针+抑制组，每组10只。模型组制备全层皮肤缺损SD大鼠模型后每天只给予碘伏消毒包扎。电针组给予模型处理后，当日即开始电针扬刺治疗，其后1次/d，共14次。电针+抑制组在每次电针扬刺治疗前10 min，腹腔注射SB203580 5 mg/kg。术后观察三组大鼠的一般行为，比较术后3、7、14 d三组创面面积愈合情况和术后3、7 d的血清相关炎性因子表达情况。结果：术后7、14 d，三组的创面面积和愈合率均优于术后3 d，差异均有统计学意义（P<0.05）;术后7、14 d，电针组的创面面积及愈合率均优于模型组、电针+抑制组，差异均有统计学意义（P<0.05）。术后7 d，三组血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于术后3 d，差异均有统计学意义（P<0.05）;术后3、7 d，电针组血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）;且电针+抑制组血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型组和电针组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：电针扬刺可抑制p38MAPK通路过度活化，降低大鼠血清中促炎因子过度表达，具有一定抗感染作用，并可加速创面修复。

【关键词】 电针扬刺 创面修复 炎性因子 皮肤缺损

[Abstract] Objective： To investigate the effects of electroacupuncture on wound repair and expression of serum-related inflammatory factors in rats based on p38 mitogen-activated protein kinase （p38MAPK） pathway. Method： A total of 30 healthy SD rats were selected and divided into model group， electroacupuncture group and electroacupuncture + inhibition group according to random number table method， 10 rats in each group. In the model group， SD rats with full-thickness skin defect were treated with iodopor disinfection bandage every day. After the model treatment， the electroacupuncture group started the electroacupuncture needling treatment on the same day， followed by 1 time/d for 14 times in total. In the electroacupuncture + inhibition group， SB203580 5 mg/kg was intraperitoneally injected 10 min before each electroacupuncture needling treatment. The general behaviors of the three groups of rats were observed after surgery， and the wound area healing status of the three groups 3， 7 and 14 d after surgery and the expression of serum related inflammatory factors 3 and 7 d after surgery. Result： The wound area and healing rate of the three groups were better than that of the three groups at 7 and 14 d after surgery， the differences were statistically significant （P<0.05）; 7 and 14 d after surgery， the wound area and healing rate of the electroacupuncture group were better than those of the model group and the electroacupuncture + inhibition group， with statistically significant differences （P<0.05）. 7 d after operation， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 of the three groups were all lower than those of the three groups， the differences were statistically significant （P<0.05）; 3 and 7 d after surgery， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the electroacupuncture group were lower than those in the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）; in addition， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the electroacupuncture + inhibition group were lower than those in the model group and the electroacupuncture group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Electroacupuncture quintuple puncture can inhibit the over-activation of p38MAPK pathway， reduce the over-expression of pro-inflammatory factors in rat serum， have certain anti-inflammatory effect， and accelerate wound repair.

[Key words] Electroacupuncture quintuple puncture Wound repair Inflammatory factor Skin defect

First-authors address： Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang University of Chinese Medicine， Hangzhou 311201， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.007

皮肤作为人体与外界环境之间的第一道屏障，是免疫系统的重要组成部分[1]。临床上各种原因（如创伤、烧伤、切割伤等）引起的皮肤缺损越来越多，而其导致的皮肤面积缺损难愈，是目前临床治疗上的难点之一[2-3]。皮肤组织的自我更新及修复可概括为炎性反应、细胞增殖分化和组织重塑三个阶段[4-5]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinases，MAPK）是一组细胞内广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是信号从细胞表面传递到细胞核内的重要传递者，而p38MAPK是MAPK信号转导的通路之一。电针刺激是一种可调动皮肤内源性电流、纠正创面内环境、加速创面修复的绿色疗法，但其内在作用机制尚不明确[6-7]。本实验基于p38MAPK通路，以电针扬刺为主要手段，观察干预后皮肤缺损大鼠创面面积及血清相关炎性因子表达的变化，从炎性反应阶段探讨基于p38MAPK通路下的电针刺激对创面修复的影响及可能的作用机制，为中医特色治疗临床皮肤缺损疾病提供有效的实验依据，开辟新的思路及方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂仪器 本实验研究时间为2018年9月-2019年5月，清洁级SD大鼠30只，雌雄各半，体重（220±20）g，购自浙江中医药大学实验动物中心，SPF级分笼饲养，温度20～24 ℃，湿度50%～70%，适应性饲养1周后进行实验，本实验经过动物伦理委员会批准同意。TNF-α、IL-1β、IL-6试剂盒（assay公司，美国）、SB203580抑制剂（selleck公司，美國）、TaKaRa试剂盒、Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）、酶标仪（Thermo Scientific Varioskan Flash）。

1.2 全层皮肤缺损模型建立 结合前期造模基础，制备全层皮肤切除创面大鼠模型。大鼠常规饲养1周，造模前12 h禁食水，麻醉后常规五点固定，造模区（左侧：脊椎左侧旁2 cm;右侧：脊椎右侧旁2 cm，选一侧）剪毛、脱毛处理，生理盐水冲洗，碘伏消毒，乙醇脱碘。利用打孔器将造模区中心皮肤进行全层切除，直径约1.5 cm，深至皮下，制造皮肤全层切除伤模型。分置清洁笼内单笼正常喂养，保持伤口干燥、防止伤口感染。

1.3 大鼠分组及处理 将30只健康SD大鼠，按随机数字表法分为模型组、电针组和电针+抑制组，每组10只。模型组制备全层皮肤缺损SD大鼠模型后每天只给予碘伏消毒包扎。电针组给予模型处理后，当日即开始电针扬刺治疗（选取创面中心一点和创面边缘正常皮肤0.5 cm处上下左右各一点，给予毫针（0.20 mm×13 mm）针刺，不施针刺手法，然后连接韩氏治疗仪进行治疗，负极位于中心，正极位于上下左右，频率2 Hz，输出电流0.6～1 mA，以毫针出现轻颤为度，1次/d，28 min/次）。电针+抑制组在每次电针扬刺治疗前10 min，腹腔注射抑制剂SB203580，剂量为5 mg/kg。各组每天均用碘伏消毒包扎，预防创口感染，喂饲标准饲料。

1.4 观察指标与评价标准 （1）一般行为学观察：实验开始后每天观察大鼠的精神状况、反应能力、摄食量、摄水量以及存活数等。（2）创面面积变化的测定：用游标卡尺测量并计算各组术后3、7、14 d创面面积和愈合率。创面面积愈合率=（治疗前创面面积-治疗后创面面积）/治疗前创面面积×100%。（3）ELISA检测：按照大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫检测试剂盒使用说明书进行操作，将标准品梯度稀释;加入样品、标准品、生物素标记二抗和酶标试剂，37 ℃反应1 h;洗板5次，加入显色液A、B，37 ℃避光显色10 min;加入终止液终止反应;上酶标仪读取吸光度（OD值）。根据标准液的检测结果得出标准曲线，求出各组样品的实际浓度。

1.5 统计学处理 所有数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用F检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组SD大鼠一般资料比较 三组SD大鼠雌雄数、体重比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

2.2 三组一般行为学观察结果 大鼠在术后首日可能因麻醉、惊吓等原因普遍精神较差，术后第2天各组大鼠摄食量、摄水量均不同程度好转并都基本恢复至正常水平，无死亡。

2.3 三组创面修复情况比较 术后3 d，三组大鼠创面面积和愈合率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;术后7、14 d，三组的创面面积和愈合率均优于术后3 d，差异均有统计学意义（P<0.05）;术后7、14 d，电针组的创面面积及愈合率均优于模型组、电针+抑制组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 三组血清相关炎性因子表达情况比较 术后7 d，三组血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于术后3 d，差异均有统计学意义（P<0.05）;术后3、7 d，电针组血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）;且电针+抑制组血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型组和电针组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

正常无损伤的皮肤往往维持一种“皮肤电池”作用。一旦皮肤受损，正常的经上皮电位会短路，电流从损伤上皮的底部流出，并在损伤处的边缘形成稳定的电流，这种电流的负极指向受损皮肤表皮的深层部分，这便是损伤性内源性电场[8-9]。大部分慢性难愈性创面表面，内源性电场强度变弱。这使得外加微电流成为促进创面修复的一种可能的治疗方案。在皮肤损伤后，创面组织和体内会形成大量炎症反应，这些炎症介质如未得到有效控制，可导致细菌的滋生繁衍，不利于创面修复[10-11]。因此，皮肤损伤后如何抑制过多的炎症反应是加速创面修复的重要环节之一。Gürgen等[12]对大鼠皮肤创面进行2 Hz、15 min的电刺激后，在真皮、肉芽组织、毛囊、皮脂腺的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性细胞因子得到了明显抑制，证明了电刺激可抑制炎症反应阶段，缩短创面愈合时间。

杜伟斌等[13]总结得到MAPK信号转导通路下的电针疗法可产生多种效应，对多种临床疾病具有较大的研究价值。在MAPK信号转导通路家族中，p38MAPK、细胞外信号调节激酶（ERK-1/2）和c-jun末端激酶（JNK）3个途径被最多研究。而p38MAPK信号通路能受到低氧、紫外线等因素刺激后发生磷酸化从细胞质转移至细胞核内，并通过调节转录因子的活性及细胞因子的合成，对炎性反应的调控和创面愈合起着关键性的作用[14-15]。有研究表明，烧伤后p38MAPK明显活化，并介导了炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生，在创面愈合中扮演着重要角色[16-17]。

皮肤创伤相当于中医学的“溃疡”“金疡”“折疡”。早在周代就有疮疡的详细记载，并成立了独立的专科。作为祖国医学的瑰宝，中医针灸在治疗骨伤科、皮肤科疾病方面一直被认为是重要的治法之一。扬刺法源自《灵枢·官针》：“扬刺者，正内（纳）一，傍内（纳）四而浮之，以治寒气之博大者也”。本法适用于病变范围大、病变位置较浅的病症，本法有舒筋活络，消肿散结，益气补血之功。电针刺激疗法是在针刺基础上外加电刺激，具有针刺及电刺激的双重效益[18]。本课题组一直从事皮肤缺损创面修复的研究，电针扬刺是指揚针刺结合电针仪，在传统针刺的基础上，外加生物电的刺激，利用两者协同作用，形成对创面的有效治疗，是对祖国医学中针灸学的一项重要革新和推进。

本研究基于p38MAPK通路，巧妙地运用扬刺法和电刺激的优势，基于创面稳态电流概念，使皮肤损伤区损伤性内源性电场得到重建，发挥改善局部微循环功能，探讨了对创面修复及血清相关炎性因子表达的影响。结果显示：术后7、14 d，电针组愈合面积和愈合率均优于模型组和电针+抑制组，差异均有统计学意义（P<0.05），提示p38MAPK信号通路是创面愈合的重要靶点，电针扬刺可有效加速创面修复的作用机制可能是抑制了p38MAPK信号通路的过度活化产生。术后3、7 d，电针+抑制组血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均低于模型组和电针组，差异均有统计学意义（P<0.05）。提示电针扬刺可抑制过度炎症反应阶段，且与一定程度的p38MAPK信号通路活化有关，这可能是缩短创面愈合时间作用机制之一。

综上所述，本研究通过电针扬刺纠正损伤性内源性电场失衡现象，重建创面稳态电流回路发现，其可有效加速创面修复。其作用机制可能是抑制了p38MAPK信号通路过度活化，降低了血清或局部组织TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，抑制了创面愈合的多度炎症反应阶段，最终缩短了创面愈合时间。然而皮肤组织修复是一个复杂的过程，包含了炎症反应、再上皮化、肉芽组织新生、早期血管化等一系列演变，这需要深入研究，发挥中医药的作用优势，进一步多靶点研究其可靠的作用机制，并为临床治疗提供有效的实验依据。

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（收稿日期：2020-03-04） （本文编辑：张爽）