FAM136A在胃腺癌中的表达及其临床意义

李佳琦 张忠 王旭光 薄威 梁伊灵 付星玮 张珉

【摘要】 目的：研究FAM136A在胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）组织中的表达水平及其临床病理学意义。方法：采用生物信息学方法在TCGA数据库中筛选出STAD中高表达的基因FAM136A。采用免疫组织化学染色法检测62例STAD以及11例癌旁组织中FAM136A的表达情况并分析其与患者年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、TNM分期等临床病理指标之间的关系。采用生物信息学方法分析STAD中FAM136A与其他调控肿瘤进展指标间转录水平的相关性。结果：生物信息学分析显示，STAD组织中FAM136A的mRNA转录水平高于癌旁组织（P<0.05）。免疫组织化学染色实验显示，FAM136A主要定位于细胞质，在STAD组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P=0.000 2）;在STAD组织中，年龄、性别的FAM136A表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05），病理分级、T分期、N分期的FAM136A表达情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。生物信息学分析显示，STAD中FAM136A表达与Cyclin D1、CDK4、MMP9及Snail1均呈正相关（P<0.05）。结论：FAM136A在STAD组织中高表达并与肿瘤进展密切相关。

【关键词】 FAM136A 胃腺癌 肿瘤进展

[Abstract] Objective： To study the expression level of FAM136A in gastric adenocarcinoma and its clinicopathological significance. Method： Bioinformatics method was used to screen out genes that were high expressed in gastric adenocarcinoma from the TCGA database. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of FAM136A in 62 cases of gastric adenocarcinoma and 11 cases of adjacent cancer tissues， and the relationship between its expression and age， gender， tumor size， pathological grade， and TNM stage was analyzed. Bioinformatics methods were used to analyze the correlation between FAM136A and other markers regulating tumor progression in gastric adenocarcinoma. Result： Bioinformatics analysis showed that mRNA transcription level of FAM136A in gastric adenocarcinoma tissues was higher than that of adjacent tissues （P<0.05）. Immunohistochemical staining showed that FAM136A was mainly localized in the cytoplasm and its expression level in gastric adenocarcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （P=0.000 2）; in STAD tissues， the expression of FAM136A by age and gender showed no statistically significant difference （P>0.05）， compared the expression of FAM136A in pathological grades， T stages and N stages， the differences were statistically significant （P<0.05）. Bioinformatics analysis showed that FAM136A expression was positively correlated with Cyclin D1， CDK4， MMP9 and Snail1 in gastric adenocarcinoma （P<0.05）. Conclusion： FAM136A is highly expressed in gastric adenocarcinoma and associated with tumor progression.

[Key words] FAM136A Gastric adenocarcinoma Tumor progression

First-authors address： Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.23.001

胃癌是最常見的恶性肿瘤之一，其死亡率在常见恶性肿瘤中居于第三位，仅2018年全世界约有100万新发病例且约有78.3万人死于胃癌[1]。胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）是起源于胃黏膜腺上皮的恶性上皮性肿瘤，胃癌大约90%是腺癌。由于部分胃癌病例临床表现不典型，就诊被延误，早期缺乏有效筛查手段，缺少有效治疗技术等多种因素，深入研究胃癌发病机制，寻找关键致病因子将有助于胃癌的防控及临床诊治。如能找到调控胃癌进展的关键分子，明确其分子机制，将有利于胃癌早期发现，靶向治疗，有利于降低病死率。因此，本研究通过生物信息学技术分析TCGA数据库中STAD及癌旁组织中差异表达的基因，筛选出136序列相似的家族成员A（family with sequence similarity 136 member A，FAM136A）基因，通过检测其表达水平，以及与肿瘤进展相关资料之间的关系，探讨FAM136A在STAD进展的调控作用，进一步通过生物信息学分析，探究在STAD中FAM136A的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2017年6月-2018年12月沈阳医学院附属中心医院经手术切除后并经病理诊断确诊的62例STAD标本以及11例癌旁组织。患者年龄38～82岁，平均（60.87±11.62）岁，男35例，女27例，病理学分级Ⅰ级26例，Ⅱ、Ⅲ级36例，出现局部淋巴结转移29例。（1）纳入标准：①符合卫生部2010年发布的《胃癌诊断标准》;②根据美国癌症联合委员会与国际抗癌联盟（AJCC）第八版进行TNM分期。（2）排除标准：①临床资料不完整;②术前接受过放射治疗、化学药物治疗及免疫治疗等辅助治疗;③合并其他组织器官癌变。经沈阳医学院伦理委员会同意，患者均签署了知情同意书。

1.2 生物信息学分析 通过Rstudio分析在TCGA数据库中筛选出FAM136A在STAD组织中的转录水平明显高于癌旁组织，并进一步分析其在STAD组织中的转录水平与其他肿瘤调控分子转录水平的相关性。

1.3 免疫组织化学染色

1.3.1 主要試剂 PBS磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.6）、抗原修复缓冲液（柠檬酸法，pH 6.0）、内源性过氧化物酶阻断剂、非免疫山羊血清封闭液、即用型免疫组化EliVision plus试剂盒（鼠/兔）、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒等均购置于福州迈新生物技术开发有限公司，FAM136A抗体（兔抗人）购于台湾Abnova公司，抗体稀释液购于美国Cell Signaling Technology公司。

1.3.2 主要方法 STAD及癌旁组织标本经10%中性福尔马林固定后，进行石蜡包埋，制作成厚度为4 μm的组织切片，所有切片均在统一条件下进行后续实验，操作方法如下：（1）采用二甲苯及梯度酒精脱蜡并水化切片;（2）加入柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液通过微波热修复法进行抗原修复;（3）经PBS洗涤后滴加内源性过氧化物酶阻断剂;（4）PBS洗涤后滴加非免疫山羊血清进行抗原封闭;（5）滴加FAM136A一抗（1︰800）4 ℃过夜孵育，同时采用PBS代替一抗作为空白对照;（6）滴加EliVision plus试剂盒中反应增强液;（7）PBS洗涤后滴加酶标抗小鼠/兔IgG聚合物，再次PBS洗涤;（8）显色，二氨基联苯胺DAB结合辣根过氧化物酶显色;（9）苏木素复染细胞核;（10）脱水、透明、封片、镜检。结果判定：在每张免疫组织化学染色切片中，随机选取10个视野（400×），并随机计数200个细胞，进行FAM136A阳性结果判定，判定标准如下：（1）染色强度：0为没有阳性染色，1为浅黄色，2为棕色，3为棕褐色;（2）阳性染色范围：阳性染色细胞数<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项评分相乘得最终评分（0～12分），得分≤6分为低表达，>6分为高表达。

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料用率（%）表示，采用字2检验及Fisher确切概率法，通过Spearman方法分析TCGA数据库中各基因表达的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAM136A在STAD组织中表达水平 通过Rstudio分析TCGA数据库中STAD及癌旁组织中差异表达的基因，筛选出FAM136A在STAD中转录水平（5.57±0.58）明显高于癌旁组织（4.45±0.33），差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2 STAD组织中FAM136A的蛋白表达情况及其临床病理学意义 STAD组织中FAM136A主要定位于细胞浆中（图2）。62例STAD患者中38例（61.3%）为高表达，24例（38.7%）为低表达。分析临床资料显示，病理学分级Ⅰ级26例，其中12例（46.2%）FAM136A高表达，14例（53.8%）FAM136A低表达;Ⅱ、Ⅲ级共36例，其中26例（72.2%）FAM136A高表达，10例（27.8%）低表达（P=0.038）。分析T分期显示，T1期为39例，其中20例（51.3%）FAM136A高表达，19例（48.7%）低表达;T2～4期为23例，其中18例（78.3%）FAM136A高表达，5例（21.7%）为低表达（P=0.035）。N0期为33例，其中16例（48.5%）FAM136A高表达，17例（51.5%）低表达，N1～3期为29例，其中22例（75.9%）FAM136A高表达，7例（24.1%）FAM136A低表达（P=0.027）。在STAD组织中，年龄、性别的FAM136A表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05），病理分级、T分期、N分期的FAM136A表达情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。STAD组织中FAM136A蛋白表达水平（7.24±2.95）显著高于癌旁组织（3.64±1.96），差异有统计学意义（P=0.000 2），见图3。

2.3 FAM136A与STAD进展相关性的生物信息学分析 对TCGA数据库中STAD数据分析显示，FAM136A转录水平与细胞周期相关蛋白Cyclin D1（图4A）、周期蛋白依赖性蛋白激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）（图4B）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）（图4C）及Snail1等促进肿瘤进展的关键分子转录水平均呈正相关（图4D）（P<0.05）。

3 讨论

FAM136A又可称为FLJ14668，基因定位于染色体2p13.3，编码蛋白表达于线粒体，蛋白序列在物种间高度保守，含有138个氨基酸，分子质量为16 kDa，其确切生物功能尚不十分明确。据报道，FAM136A蛋白在人内耳中表达，在内耳发育过程中，FAM136和DTNA同时存在于耳蜗和前庭器官，FAM136A蛋白在小鼠内耳中有差异表达[2-4]。在美尼尔综合征中，发现FAM136A发生突变，FAM136A可能是早期内耳发育的重要蛋白[5]。也有研究发现，FAM136A的表达与重症肌无力的眼肌麻痹相关[6]。但其在肿瘤中的表达水平及表达意义尚未被揭示。序列相似家族成员中，有研究发现，FAM136B在维吾尔族食管癌患者中高表达，通过负向调控K乙酰转移酶5发挥作用[7]。FAM83A在肺腺癌组织中高表达且与不良预后呈正相关[8-11]。这些研究提示序列相似家族成员在肿瘤中的调控作用需深入研究。

本研究发现，FAM136A蛋白主要定位于细胞质中，其在STAD组织中高表达并与肿瘤临床分期、肿瘤浸润及淋巴结转移有关。这提示FAM136A对STAD进展发挥促进作用，为进一步探究FAM136A调控STAD肿瘤进展的分子机制，笔者通过生物信息学分析发现，在STAD组织中，FAM136A转录水平与Cyclin D1、CDK4、MMP9及Snail1转录水平均呈正相关。Cyclin D1和CDK4为细胞周期相关蛋白，Cyclin D1在G1早期表达，是细胞周期的启动因子，也是生长感受器，Cyclin D1可与CDK4等蛋白结合，激活CDK激酶活性，促进细胞从G1到S期转换，加速细胞增殖。在胃癌等多种肿瘤组织中，常发生Cyclin D1和CDK4过度表达活化进而加速肿瘤增殖[12-13]。FAM136A与Cyclin D1、CDK4转录水平呈正相关，提示FAM136A可能通过调控细胞周期促进STAD肿瘤增殖。在胃癌组織中，癌细胞常通过上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）破坏细胞间接触并获得运动转移能力，Snail是EMT正向调节因子，常在胃癌等恶性肿瘤组织中高表达，通过抑制E-cadherin表达破坏细胞间接触，Snail高表达常与肿瘤组织分级及局部淋巴结转移密切相关[14-17]。EMT转化过程中，癌细胞还通过分泌并活化MMP9等蛋白酶破坏细胞外基质，便于肿瘤细胞侵袭转移[18-21]。本研究发现，FAM136A在STAD组织高表达且与肿瘤组织学分级、局部浸润及淋巴结转移有关，结合生物信息学分析提示FAM136A可能通过调控Cyclin D1、CDK4、MMP9及Snail1等分子促进肿瘤增殖，加速EMT转化，促进肿瘤侵袭、转移，其具体调控分子机制尚需进一步深入研究。

综上所述，FAM136A在STAD组织中高表达且与肿瘤进展密切相关，FAM136A有可能成为STAD临床诊断及治疗的新靶点。

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（收稿日期：2020-02-01） （本文编辑：张爽）