胶体金检测试纸卡在检测非洲猪瘟病毒抗体上的应用

张元峰 刘锡玲 毕 路 李 佳 方 瑞 李 乾 赵俊龙 毕丁仁 黄 丽 步志高 翁长江*

1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/ 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150069；2.武汉观锐生物科技有限公司，武汉430070；3.武汉科维创生物科技有限公司，武汉430014

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）引起的一种急性、出血性、烈性传染病[1]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。2018年8月3日，我国辽宁省某养殖场生猪发生疑似ASF 疫情，经确认并上报OIE 确诊为我国首例非洲猪瘟[2]。而后疫情相继席卷全国，截至2020年1月初，国内共报告发生162 起非洲猪瘟疫情，共扑杀染疫生猪约120 万头，造成了巨大的经济损失[3]。因非洲猪瘟病毒的感染机制复杂，基因型多，全球尚无安全有效的商品化疫苗，其防控难度较大。

非洲猪瘟的早期快速诊断包括病原学检测和血清学检测，OIE 推荐的ASF 实验室检测方法有病毒分离、PCR、ELISA 和荧光抗体试验等。在ASF 暴发初期，普遍采用PCR 检测病原以确诊病例，但在ASF 呈地方流行趋势后，病原检测试验（FAT）和血清学试验（IFA）的结合有利于对可疑病例、隐性病例进行确诊。ELISA 方法是目前最常用的血清学诊断方法，用于抗体的检测，已有多项研究报道采用非洲猪瘟病毒p72、p54、p30 等基因表达重组蛋白并建立了非洲猪瘟病毒抗体ELISA 检测方法[4-7]。ELISA 检测方法一般在实验室中进行，需要一定的设备，同时相对耗时较长，而胶体金免疫层析技术因其快速、灵活、灵敏的特点，在临床快速检测诊断中尤为适合。本研究对采用胶体金免疫层析技术制备的快速检测试纸卡检测非洲猪瘟病毒抗体的性能和效果进行评估。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡，由武汉观锐生物科技有限公司和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所共同制备，批号：200501，有效期至2021年5月。

2）非洲猪瘟病毒阻断ELISA 抗体检测试剂盒，购自西班牙INGENASA，批号：011019-B，有效期至2021年10月。

3）非洲猪瘟病毒间接ELISA 抗体检测试剂盒；非洲猪瘟病毒标准阳性血清，标准阴性血清，猪流行性腹泻病毒（PEDV），猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），猪瘟病毒（CSFV），伪狂犬病毒（PRV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体阳性血清，大肠杆菌BL21 空载体阳性血清，均由中国农业科学院哈尔滨兽药研究所制备并提供。

4）猪临床血清230 份，从湖北、河南、江西、上海等地采集或送检。

1.2 方 法

1）敏感性试验。将非洲猪瘟病毒标准阳性血清（ELISA 测定效价，1∶32 768）用稀释液倍比稀释后，用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测，以肉眼能观察到检测线处有红色沉淀线出现的血清最高稀释倍数为试纸卡的检测敏感度。

2）特异性试验。用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡分别检测非洲猪瘟病毒标准阳性血清、标准阴性血清和5 种其他病毒标准阳性血清（PEDV、TGEV、CSFV、PRV、PRRSV）以及大肠杆菌BL21 空载体阳性血清，进行试纸卡特异性评价。

3）已知阳性血清检测试验。用非洲猪瘟病毒分离株（ASFV/HLJ/2018-△X）攻毒3 头SPF 猪（编号123），分别在攻毒第0 天、第5 天、第8 天采集并分离猪血清（P4 实验室完成），再用非洲猪瘟病毒ELISA 抗体检测试剂盒和非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测。

4）符合率实验。临床采集230 份猪血清样品，每份样品用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测，同时用西班牙INGENASA 非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒检测，并将检测结果进行比较，评价二者的符合率。

2 结果与分析

2.1 敏感性试验

用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测倍比稀释后的非洲猪瘟病毒标准阳性血清，结果如图1。当稀释度达1∶256 时，检测线处仍然呈现肉眼可见的清晰的红色沉淀线，表明试纸卡检测标准阳性血清的敏感度为1∶28，说明本研究制备的试纸卡在非洲猪瘟病毒抗体检测临床应用中的敏感性较高。

2.2 特异性试验

用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测ASFV 标准阳性血清、标准阴性血清、空载体血清及5 份其他病毒标准阳性血清时，结果如图2 所示。试纸卡除检测非洲猪瘟病毒标准阳性血清为阳性（检测线显色）外，其余血清均为阴性（检测线不显色），表明试纸卡的特异性很强。

图1 非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡敏感性试验

2.3 已知阳性血清检测试验

用间接ELISA 试剂盒和试纸卡方法同时检测3头攻毒前（0 天）、攻毒第5 天、第8 天采集分离的猪血清，如表1 和图3 所示。ELISA 和试纸卡均在攻毒后第8 天检测出非洲猪瘟病毒抗体，表明非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡与ELISA 方法检测结果一致，均能在猪感染非洲猪瘟病毒后及早地检测到抗体。

2.4 与进口非洲猪瘟病毒抗体检测ELISA 试剂盒符合率试验

将230 份临床猪血清样品同时用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡和西班牙INGENASA 非洲猪瘟病毒阻断ELISA 抗体检测试剂盒检测。结果如表2 所示，试纸卡检出阳性血清样本101 份，阴性血清129份；ELISA 试剂盒检出阳性血清110 份，阴性血清120 份。其中，阳性符合率80%，阴性符合率为89.2%，总符合率为84.8%，表明二者有很高的符合率。

图2 非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡特异性试验

表1 ELISA 方法和非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测攻毒猪血清结果

图3 非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测攻毒猪抗体结果

表2 非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡与进口非洲猪瘟病毒抗体检测ELISA 试剂盒的比较

3 讨 论

我国非洲猪瘟暴发流行已近2年，防控非洲猪瘟将成为养猪企业的一项重要长期任务。按一般传染病流行规律，非洲猪瘟病毒毒力可能会下降，使病程呈向亚急性或慢性发展，发病猪群死亡率下降，耐过或无症状感染猪增多，带毒猪可能呈间歇式排毒状态，因而活体采样检测核酸或抗原有时均呈阴性。但由于非洲猪瘟病毒抗原性强，康复猪或隐性带毒猪循环抗体长时间呈阳性，且效价极高，因而很容易被快速检测法检测出来。所以，在非洲猪瘟流行中、后期，对致死率不高的发病群中的病猪作“拔牙”式处理，结合严格的生物安全措施和早期诊断与鉴别技术，精准淘汰PCR 阳性或抗原阳性或抗体阳性猪只，能取得很好的防控效果。我国农业农村部发布的非洲猪瘟防控强化措施指引中指出，对自检阳性猪群且无异常死亡的养殖场，可按照“精准扑杀、定点清除”策略对生猪进行处置[8]。

本研究采用双抗原夹心法制备出非洲猪瘟抗体检测试纸卡，该试纸卡特异性强、灵敏度高，能快速查出猪群中外观正常的隐性感染猪，被查出的这部分高效价抗体阳性猪可能会带毒，是猪群中的危险传染源，必须予以淘汰，以斩断非洲猪瘟的流行和蔓延。因此，非洲猪瘟抗体检测试纸卡的研制成功为我国非洲猪瘟的控制与根除提供了很好的技术支持。