93例结核性脑膜炎患者脑脊液分离株耐药性检测结果分析

冯莹 马进宝 杨翰 杨元利 任斐

结核病是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。2018年，全球新发结核病患者约1000万例，新增利福平(RFP)耐药结核病约50万例，其中78%为耐多药结核病[1]。结核性脑膜炎(tuberculosis menigitis, TBM)约占全部结核病患者的1%，病亡率高达26.8%[2]；TBM一般依赖于临床诊断，病原学检查阳性率低，因此耐药性检测及诊断非常困难，一旦出现耐药，其治疗将更加困难。本研究通过对西安市胸科医院2013年12月至2019年12月脑脊液(CSF)分枝杆菌培养阳性且菌种鉴定为结核分枝杆菌的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果进行分析，为本地区TBM的早期诊治提供参考。

资料和方法

一、研究对象

收集西安市胸科医院2013年12月至2019年12月93例CSF培养阳性且菌种鉴定为结核分枝杆菌的药敏试验结果。其中初治75例(80.6%)，复治18例(19.4%)；男 52 例(55.9%)，女41例(44.1%)；年龄2～73岁，中位年龄26.5岁。

二、液体培养及药敏试验

采用BACTEC MGIT 960培养系统(简称“MGIT 960系统”)进行液体培养，参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[3]进行操作。取处理好的脑脊液标本0.5 ml加入MGIT液体培养管中，放入MGIT 960系统中进行培养，培养阳性标本，进一步用MPB64单克隆抗体(杭州创新生物检控技术有限公司)进行测定，鉴定为结核分枝杆菌菌株者进行表型药敏试验。一线抗结核药品异烟肼(INH)药物浓度为0.1 μg/ml，利福平(RFP)药物浓度为1.0 μg/ml，乙胺丁醇(EMB)药物浓度为5.0 μg/ml，链霉素(Sm)药物浓度为1.0 μg/ml；二线抗结核药品阿米卡星(Am)药物浓度为1.0 μg/ml，卷曲霉素(Cm)药物浓度为2.5 μg/ml,左氧氟沙星(Lfx)药物浓度为2.0 μg/ml，莫西沙星(Mfx)药物浓度为2.0 μg/ml，丙硫异烟胺(Pto)药物浓度为40.0 μg/ml，对氨基水杨酸钠(PAS)药物浓度为1.0 μg/ml。

三、统计学分析

使用SPSS 18.0软件进行数据整理及统计分析，采用χ2检验、Fishier精确检验(当最小理论值小于5时采用)统计分析各组间耐药率的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、从CSF分离的结核分枝杆菌菌株的耐药顺位

93例TBM患者CSF中分离培养出的结核分枝杆菌56株(60.2%)对抗结核药品均敏感。其余37株(39.8%)对至少一种一线抗结核药品耐药。耐药率从高到低分别为INH(31.2%)>Sm(25.8%)>RFP(21.5%)>Lfx(7.0%)>EMB(5.4%)=PAS(5.4%)>Mfx(3.2%)=Am(3.2%)=Cm(3.2%)>Pto(0.0%)。其中12株(9.7%)为单耐药，在单耐药患者中耐药率最高的仍为INH(5.4%)，19株(20.4%)为耐多药(表1)。

表1 93例TBM患者CSF中分离出的结核分枝杆菌对抗结核药品的耐药情况

二、耐多药TBM患者的耐药谱

在19例耐多药TBM患者中，最常见的耐药谱为INH+RFP+Sm(47.4%)，其次分别为INH+RFP+Sm+氟喹诺酮类(fluoroquinolones ，FQs)(15.8%)和INH+RFP+EMB+Sm(10.5%)(表2)。

表2 19例耐多药TBM患者的耐药谱

三、初、复治TBM患者CSF分离的结核分枝杆菌耐药性检测结果

初治TBM患者耐药率从高到低为INH(29.3%)、Sm(20.0%)、RFP(17.3%)、EMB(4.0%)、Cm(4.0%)、Lfx(2.7%)、Am(2.7%)、Mfx(1.3%)、PAS(1.3%)。复治TBM患者耐药率从高到低为Sm(50.0%)、INH(38.9%)、RFP(38.9%)、Lfx(27.8%)、 PAS(22.2%)、EMB(11.1%)、Mfx(11.1%)、Am(5.6%)。INH、EMB、Am、PAS、Cm、Mfx在初、复治患者中耐药率差异无统计学意义(P≥0.05)。RFP、Sm、Lfx在复治患者中的耐药率高于初治患者, 差异有统计学意义(P<0.05)(表3，4)。

讨 论

TBM作为最严重的肺外结核，有高病亡率和高致残率。随着结核病的耐药率增高，耐药菌株的不断扩散，TBM的诊断和治疗更加困难[4]。快速诊断及早期合理治疗是减少TBM神经系统缺陷与死亡的关键，因此需要尽可能选用血脑屏障渗透性高的敏感药品。临床分离菌株的药敏试验结果在化疗方案制定中占据着举足重轻的地位[5]，但由于CSF结核分枝杆菌载量较低，培养阳性率低[6]，TBM相关耐药谱的研究少有报道，所以亟需大量的多中心研究。

表3 初、复治TBM患者对一线抗结核药品的耐药率比较分析

表4 初、复治TBM患者对二线抗结核药品的耐药率比较分析

一、耐药TBM并不少见

TBM常继发于身体其他部位的结核病灶，绝大部分原发灶分布在肺部和气管、支气管淋巴结，也可以是肠系膜淋巴结及泌尿生殖器的结核或骨结核，这些病灶中的结核分枝杆菌通过血行播散进入中枢神经系统引起TBM；另外结核分枝杆菌也可以从颅骨或脊椎的结核病灶直接破入颅内或椎管内引起发病。临床中观察到的TBM多为初治患者，一般认为肺外结核耐药率并不高于肺结核[7-8]。因CSF中分离出结核分枝杆菌的概率低，故其耐药率尚不清楚。目前耐药TBM患者的报道多数来自结核病高负担国家[9]。在印度，耐多药TBM占5.5%，但对RFP的耐药率仅为0.5%；越南的一项研究中，耐多药TBM占4.7%；欧、美发达国家报告TBM患者中的耐多药及对RFP的耐药率普遍偏低[10-11]。Wang等[12]研究发现，在我国西南地区近6年TBM患者CSF培养阳性分离的42株菌株中，整体耐药率为31%，其中对INH耐药者占23.8%，对RFP耐药者占7.1%，耐多药者占4.8%。笔者的研究数据为TBM患者CSF培养阳性分离菌株，整体耐药率为39.8%；其中对INH的耐药率达31.2%，RFP为21.5%, 耐多药为20.4%。Wang等[12]的研究数据与笔者的研究数据相比较，总的耐药顺位大致相同；但本研究中TBM患者的耐药率偏高，考虑与我院为陕西省结核病定点医院，同时辐射甘肃、青海等西北地区周边省市，收治危重耐药患者较多有关。因此，在制订TBM治疗方案时需根据本地区耐药情况，并参照我国最新《耐药结核病化学治疗指南(2019年)》[13]选药。

二、 INH及RFP耐药

INH在CSF中的药物浓度约为血清药物浓度的80%～90%，鞘内注射可提高INH在CSF中的浓度，改善CSF环境，是敏感TBM化疗的核心药品[6,14]。笔者和欧美国家一些学者[10-11,15]的研究发现对INH 的耐药率较高，一旦发生对INH耐药，将在很大程度上影响TBM的治疗效果。INH快速乙酰化导致的INH低血药浓度可能是影响TBM治疗的另一因素，对INH快乙酰化患者给予大剂量INH可能改善治疗结局[16]。笔者发现，93例菌株中，对RFP的耐药率仅次于INH、Sm，而且复治患者对RFP的耐药率明显高于初治患者(P<0.05),考虑与复治患者有RFP药物暴露史有关。因此，在组成化疗方案时，获得患者既往用药史能够更有把握组成有效抗结核药品治疗方案。对于复治、治疗效果差的TBM患者，应高度警惕对RFP耐药的可能。对INH、RFP耐药者，其对治疗结局的影响是灾难性的，美国和越南的数据提示对INH耐药患者的死亡率明显增高[17-18]。当对INH与RFP同时耐药时，大部分患者在取得传统表型药敏试验结果之前就已经死亡。如何从TBM患者的CSF中快速分离培养出结核分枝杆菌并尽早取得药敏试验结果，尤其是对INH、RFP的药敏试验结果，是今后TBM诊断和治疗的重要方面。

三、对FQs耐药不容忽视

FQs作为二线抗结核药品中A组药品，其是否耐药对TBM的预后意义重大[6]；因为FQs的早期杀菌活性接近INH，而且具有良好的渗透性，其CSF浓度为血清药物浓度的70%～80%。有研究表明，早期，尤其是患者昏迷前，在4种一线抗结核药品方案中加用Lfx，可提高TBM患者的生存率[19-22]。本组93例菌株中，对Lfx的耐药率仅次于INH、Sm、RIF，居二线抗结核药品首位。Lfx在复治患者中的耐药率也显著高于初治患者(P<0.05)。本地区对Lfx的高耐药率可能与呼吸结核领域不规范使用该药有关；我国社区获得性肺炎将FQs作为推荐药品行经验性抗感染治疗，另外部分结核病医院对初治患者即采用FQs类药品治疗，这些初治失败的患者很有可能对FQs耐药[23]。在本研究中，对Mfx的耐药率低于Lfx，考虑与其最小抑菌浓度低有关；同时Mfx更容易透过血-脑屏障，使其在CSF中的浓度较高，其抗菌活性是Lfx的2倍，且患者耐受性好[24-25]。因此，如果考虑使用FQs以加强抗结核化疗方案，选择Mfx可能更加有效[26]。耐多药TBM耐药谱中最常见的为INH+RFP+Sm(47.4%)，其次为INH+RFP+Sm+FQs(15.8%)，也与本地区对Lfx的高耐药率有关。值得注意的是，在笔者的研究中，CSF结核分枝杆菌分离株耐药谱为INH+RFP+Sm+FQs的患者均为复治患者，因此应重视对FQs药品的合理应用，尤其是管控好初治肺结核患者治疗过程中对Lfx的使用。

四、血脑屏障通透性对制订TBM方案的影响

不良的血脑屏障通透性，导致CSF中药物浓度水平欠佳，是TBM预后差的另一重要原因。一旦发现耐药，应根据药敏试验结果尽早采用对血脑屏障通透性好的药品替代。FQs(通透性约70%～80%)、环丝氨酸(cycloserine，Cs)(通透性约80%～90%)、Pto(通透性约80%～90%)可能是很好的选择，上述药品在CSF中的浓度较高；其他二线抗结核药品如利奈唑胺(linezolid，Lzd)则个体差异较大，通透性约30%～70%[6]。在本研究中未发现对Pto耐药的情况，所以制订本地区耐多药TBM化疗方案时可酌情考虑选用Pto。

在本研究中，TBM患者CSF培养阳性分离菌株对Am、Cm的敏感性较好。但Am、Cm在CSF中的浓度仅为血清药物浓度的10%～20%；在TBM急性炎症期，Am、Cm渗透率增高。所以当本地区其他药品获取困难或受药品不良反应限制时，可酌情考虑TBM化疗方案中加用该类药品。PAS和EMB在中枢神经系统中无渗透或渗透率很低[6,14]，并且在本地区有一定的耐药率，故在TBM尤其是耐多药TBM治疗中的作用有限。

五、本研究的意义和局限性

综上所述，93例TBM患者CSF临床分离菌株对一线抗结核药品INH、Sm、RIF的耐药现象较为严重，二线抗结核药品中对Lfx的耐药现象较为严重，且复治患者中对RFP、Sm、Lfx的耐药率明显高于初治患者。因此，在本地区采用Pto、Mfx则更有把握组成有效的抗结核化疗方案，同时可酌情加用二线针剂类抗结核药品。应强调重视抗结核药品的合理使用，并尽快至少对INH、RFP、FQs进行快速耐药性检测，对制订化疗方案、改善TBM患者预后有重要意义。本次研究不足之处在于未纳入患者临床症状及治疗结局，对预后评估作用有限。