关于大豆发芽过程中抗原蛋白的变化研究

毛 悦 聂振昌 唐香山

（唐人神集团股份有限公司，株洲412000）

大豆作为饲料中主要的植物型蛋白来源，其蛋白含量较高， 对于生长猪而言， 其消化率也较高， 大部分氨基酸的消化率介于80%-90%之间。 但是这些指标主要是对于生长猪而言，大豆中也存在较多的抗营养因子， 由于早期仔猪的胃肠道发育不完善， 对植物型蛋白源消化能力较差， 有研究表明大豆中的抗营养因子会引起仔猪肠道消化膜损伤， 尤其部分抗原蛋白即使经过热处理也会造成肠道炎症。 但是大豆经过发芽处理后， 种子内部的淀粉、 脂肪以及蛋白质会逐步分解， 限制性氨基酸等物质的含量也有所提高， 风味得到改善。 本实验主要观察大豆抗原蛋白的变化， 以利用发芽大豆作为仔猪植物型蛋白来源提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 试验材料

大豆： 地方品种株洲市超市购买； 该实验所需试剂丙烯酰胺、 Beta-巯基乙醇、 过硫酸铵等均为分析纯试剂。

1.2 试剂与仪器

康丽CN-A323B 大豆发芽机、 101-2AB 电热鼓风干燥箱箱、 FW-100 手提粉碎机、 AL204型分析天平、 六一蛋白电泳系统。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆样品制备

挑选优质黄大豆， 清洗， 浸泡， 在发芽机内加入足够的水， 室温下发芽， 每天浇水一次并取一定量的发芽大豆样品， 实验期维持6 天，样品选取发芽第0、 1、 2、 3、 4、 5、 6 天的黄豆， 整株在烘箱内55℃烘干， 手提粉碎机粉碎备用。

1.3.2 SDS-page 试验试剂配制

①样品浸提液： Tris 3.63 g， Beta-巯基乙醇0.7 ml 定容至1L， 用HCL （HCL： H2O=1:1）调节PH 为8.0。 ②30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺30 g，双丙烯酰胺0.8 g， 去离子水定容至100 ml。 ③4×堆 积 胶 缓 冲 液： 1 mol/L Tris-HCL （PH=6.8） 50 ml， 10% SDS 4 ml， 蒸 馏 水46 ml，10%过硫酸铵5 ml。 ④电泳缓冲液： Tris 3 g，甘氨酸 14.4 g， SDS 1 g， 定容至1 L， 调节PH 至8.3。 ⑤5×样品缓冲液： 1 mol/L Tris-HCL(PH=6.8) 0.6 ml， 50%甘油 5 ml， 10% SDS 2 ml， Beta-巯基乙醇0.5 ml， 1%溴酚蓝1 ml，蒸馏水0.9 ml。 ⑥染色液： 考马斯亮蓝0.25 g，甲 醇45.4 ml， 冰 醋 酸9.2 ml， 去 离 子 水45.4 ml。 ⑦脱 色 液： 甲 醇114 ml， 冰 醋 酸18 ml，去离子水118 ml。

表1 浓缩胶和分离胶配方

1.3.3 SDS-page 电泳

取不同天数的发芽大豆烘干样1 g， 加入20 ml 提取液， 室温条件下浸泡1 h， 每隔10 min充分混匀， 之后8000 rpm 离心20 min， 取上清液20 μl， 加入40 μl 上样缓冲液， 沸水浴3 min后8000 rpm 离心5 min。

取样品处理后上清液上样， 浓缩胶跑电泳时电压稳定保持80 V， 分离胶的电压调为120 V。电泳结束后， 小心切去浓缩胶， 放入新鲜染色液染色45 min， 用自来水漂去剩余染液， 直至水流无色， 之后倒入脱色液脱色， 每隔2 h 换一次脱色液， 直至蛋白条带清晰可见。

2.结果与分析

2.1 SDS-page 凝胶电泳结果

如图1 中标识所示α、 α’、 β 是未发芽大豆中大豆抗原蛋白7 S 的三个亚基， A1、 A2、 A3、A4、 Basic 是大豆抗原蛋白11S 的五个亚基。

将大豆发芽的跑胶图导入Photoshop 中将图像全部转换为8 位灰度进行处理， 之后导入GelAnalyzer2010a 进行前处理， 对应对照抗原蛋白特定区域选取所需泳道以及所需条带， 得出峰面积结果， 该区域峰面积较大则该条带蛋白含量高。

表2 各亚基占大豆抗原蛋白总量的比例

图1 大豆发芽抗原蛋白SDS-page 跑胶结果图

图2 GelAnalyzer 特征抗原条带峰面积图

图3 GelAnalyzer 处理条带峰面积处理结果

从SDS-page 凝胶电泳整体情况分析， 如图3 所示大豆发芽第1 天至第6 天蛋白条带都出现明显降解， 随着时间的推移， 大分子蛋白条带逐渐变浅， 同时小分子蛋白条带逐渐增多， 大豆发芽时酶的活化最为明显， 随着发芽时间的延长， 在蛋白酶的作用下， 蛋白质含量组成不断发生变化， 大分子蛋白含量随发芽时间的延长逐渐降低， 小分子蛋白含量则有所增加， 发芽期间发生了蛋白质、 氨基酸种类的变化。

根据峰面积处理结果图， α 处发芽1-5 天蛋白含量处于下降， 第6 天变化不明显， α’ 处随着时间推移慢慢变浅； β 处1-3 天变化缓慢，第3-5 天变化明显， A3 处均逐步变浅； A1、A2、 A4 处1-3 天变化缓慢， 第3 天-第4 天变化明显， 4-6 天变化不明显。 因此对于整体发芽情况， 7S、 11S 抗原蛋白均有所下降， 下降趋势基本一致。

大豆发芽过程是一个大分子蛋白不断降解成小分子蛋白的过程， 随着时间的推移， 新的蛋白质不断形成， 大豆内源蛋白酶的种类随着时间的变化而发生了一系列的变化， 由文献了解到发芽1-4 天， 蛋白酶以切割大分子蛋白的内切酶为主， 此时SDS-PAGE 电泳图中大分子量的蛋白条带逐渐变淡， 小分子量的蛋白条带不断形成； 发芽4-6 天， 蛋白酶主要作用于一些分子量较小的蛋白， 这一时期大分子蛋白条带被继续分解至完全消失， 小分子蛋白条带清晰形成， 结果基本一致。

3.总结

本实验通过大豆发芽处理， 检测其大豆抗原蛋白含量的变化。 上述结果表明， 发芽后5天其大豆抗原蛋白有了明显的降解， 考虑到大豆发芽时间过长， 一般在6-7 天会开始腐败，根据上述结果与后续生产效率的要求， 建议大豆在第5 天终止发芽。

参考文献 （略）