柴芍承气汤对脓毒症大鼠小肠损伤的超微结构及NF-κB 信号通路影响的研究

吴深宝 金忠海 宋俊英 徐小宏

（1 温州医科大学附属义乌医院消化科 浙江 义乌 322000）

（2 温州医科大学附属义乌医院中药科 浙江 义乌 322000）

（3 浙江中医药大学附属第一医院乳腺外科 浙江 杭州 310005）

脓毒症症是一种严重临床综合征,是炎症反应受损的结果，以异常的生理、生物和生化过程为特征。根据一项国际性数据库回顾分析，1995 年—2015 年，全球脓毒症发生率的比率是437/100,000，每 100,000 例中有270 例发生严重败血症[1]。脓毒症引起多器官衰竭增加病死率[2]。脓毒症诱导小肠上皮细胞功能多重紊乱，包括上皮细胞凋亡增加，屏障功能障碍和细胞因子产生[3]。预防脓毒症诱导的小肠细胞凋亡可以提高脓毒性腹膜炎和肺炎的存活率2 到10 倍。 柴芍承气汤（ChaiShao Chengqi Decoction，CSCD）对缺血再灌注肠损伤有一定保护作用，减少小肠细胞凋亡[4]。盲肠结扎和穿刺（CLP）是一种设计合理，易于操作和廉价的实验性微生物脓毒症休克模型，也符合人类败血症的动物模型[5-7]。CSCD 对CLP 引起脓毒症小肠损伤的保护作用研究极少。本研究以CLP 大鼠脓毒症为模型载体，研究CSCD 对脓毒症小肠损伤的保护作用及可能的机制。

1.材料与方法

1.1 动物分组及脓毒症模型的制备

30 只雄性Wistar 大鼠，体重320 ± 30g。购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。随机分为3 组：对照组（10只）、模型组（10 只）和中药组（5ml/100g，10 只）。造模与给药：实验大鼠术前禁食12h，不禁水。中药组术前1h 灌胃给药，对照组和模型组给予等体积生理盐水。采用大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)制造脓毒症大鼠动物模型[8]。造模6h 后处死大鼠。造模过程中及造模后各组大鼠均未死亡,存活率100%。

1.2 CSCD 的制作和使用方法

汤方由本院中医科提供，中药房熬制，汤方组成如下：柴胡10g，白芍10g，黄芩10g，枳实10g，厚朴10g，玄明粉(冲)10g，生大黄(后下)10g。前5 味中药煮沸18min 后熄灭热源，将生大黄加入浸泡2min，之后倒出汤液，再加入玄明粉，冷却后即可使用。造模成功后中药组按实验要求每6h 经口灌入1 次，剂量为5ml/100g 体质量，直至被处死为止；对照组灌入同等剂量的无菌生理盐水。

1.3 将取好的新鲜标本，用磷酸缓冲液清洗，2.5%戊二醛重悬，1%锇酸固定，乙醇梯度脱水，环氧丙烷：epon 树脂=2：1 渗透过夜，包埋，超薄切片，70nm，铅铀染色后电镜观察并拍照。

1.4 准确称取小肠组织重量，按重量（g）：体积（ml）=1：9 的比例，加入9 倍体积的匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，3500 转/分，离心10 分钟，取上清液检测各组大鼠小肠组织中的髓过氧化物酶（MPO）。

1.5 Western blot 分析

将各组小肠组织按每20mg 组织加入150-250μl 裂解液的比例加入裂解液，提取蛋白；将各组蛋白等量上样，经过电泳、转膜、封闭。根据说明书NF-κB 1：500 和GAPDH 1：1500 稀释抗体，4℃孵育过夜。按照1：1000 稀释HRP 标记的二抗，与膜37℃孵育1h。采用紫外投射凝胶成像系统扫描后，应用Quantlty one 软件进行灰度值分析。计算样本目的蛋白灰度值/内参基因条带灰度值的比值，即蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS13.0统计学软件分析处理，计数资料采用率（%）表示，行χ2检验，计量资料用均数±标准差（±s）表示，行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 大鼠小肠细胞透射电镜观察结果

对照组：组织结构较为致密，部分区域出现自溶现象，线粒体数量较多且结构清晰可见内嵴；模型组：组织结构松散，出现自溶现象，线粒体数量少，崩解严重，形成大量空泡；中药组：组织结构松散，出现自溶现象，线粒体数量较多，大量线粒体崩解，部分线粒体内嵴清晰,见图1。

图1 各组小肠组织的透射电镜观察

2.2 大鼠小肠黏膜组织NF-κB 的表达

与对照组 相比，模型组NF-κB 表达水平明显升高，有统计学意义（P＜0.05），中药组与模型组相比，NF-κB 表达水显著下降，有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 各组小肠黏膜组织NF-κB 的表达

2.3 大鼠小肠组织MPO 的水平

MPO 对照组表达为1.04±0.16u/克组织湿重 ，模型组为3.46±0.21U/克组织湿重，组织湿重,2.64±0.16U/克组织湿重，两两比较，均有统计学差异（P ＜0.05）。见图3。

图3 各组小肠黏膜组织MPO 的表达

3.讨论

C S C D 是一种传统中药方剂，据报道它具有肠道屏障保护作用。本研究检测了CSCD 对CLP 诱导的脓毒症小肠损伤的保护作用具体分子机制。

小肠是败血症中敏感的器官。本研究通过透射电镜观察，发现脓毒症大鼠组小肠组织组织结构松散，自溶，线粒体崩解严重，形成大量空泡；中药组小肠组织也表象结构松散，自溶，但线粒体崩解较脓毒症组明显减少，部分可见内脊。证实CSCD 对脓毒症引起的肠损伤有部分保护作用。

M P O 是中性粒细胞的功能标志和激活标志。中性粒细胞活化后释放炎症因子，引起肠组织损伤。本研究中，我们发现脓毒症时肠组织中M P O 明显增高，表明中性粒细胞等炎症细胞浸润增多，C S C D 可明显降低M P O 表达水平，提示C S C D通过抑制中性粒细胞浸润，从而减轻小肠炎症损伤。

已经证明NF-κB 介导大量基因的转录，其产物在脓毒症病理生理学中具有重要作用[9]。 缺乏NF-κB 依赖性基因的小鼠减少脓毒性休克和脓毒症相关病死率[10]。本研究表明，在C L P 诱导的脓毒症大鼠小肠组织中，N F-κ B 表达明显升高，CSCD 抑制大鼠小肠组织中NF-κB 的表达，提示CSCD 对NF-κB 信号传导途径有抑制作用，从而减轻脓毒症小肠损伤。

总之，本研究的结果表明，CSCD 改善脓毒症小肠组织损伤，CSCD 的这种保护作用与其抑制中性粒细胞浸润和NF-κB信号通路减轻炎症反应有一定关系。