肝细胞癌中CCT4 基因的表达及其临床意义

俞旭东 钱叶本（通讯作者）

（安徽医科大学第一附属医院 安徽 合肥 230022）

肝细胞癌是全球范围内发病率排名第六的癌症，并且是导致患者死亡的第四大最常见原因，其特点是高度增殖、异质性和侵袭性[1]。肝癌治疗方法多样，主要包括根治性切除术、肝移植术、射频消融术及放疗和化疗等方法。但其临床疗效有限，复发率高，肝癌患者的生存率较低[2,3]。目前肝癌缺乏特异性预后标志物。TCP1 环复合物是一种ATP 依赖性分子伴侣蛋白，其由八个不同的亚基（命名为CCT1 至CCT8）组成。TCP1 环复合物可以折叠肌动蛋白和微管蛋白，参与癌细胞的增殖，迁移[4-5]。作为TCP1 环复合物的亚基，CCT4 在恶性肿瘤中的作用鲜有报道。本文基于癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共数据库肝癌组织标本数据，利用生物信息学分析CCT4 在肝癌中的表达并使用PCR 和免疫组化验证；同时还分析了其异常表达在肝癌患者中的临床意义和其潜在机制。本文旨在阐明CCT4 在评估肝癌患者预后中的价值。

1.资料和方法

1.1 数据下载和处理

从TCGA 数据库 (https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) 下载374 个HCC 组织和50 个正常肝组织样品的mRNA seqV2 表达谱数据和377 例HCC 患者的临床病理数据。下载的临床数据包括的指标为生存期、生存状态、年龄、性别、分级和TNM 分期。

1.1.1 差 异 表 达 分 析 使 用limma 包(http：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)分析CCT4 在TCGA 数据库中所包含的374 个HCC 组织和50 个正常肝组织样品中的表达差异。

1.1.2 生存曲线 剔除TGCA 数据里中肝癌样本中生存数据不全的患者，剩余370 例患者。以CCT4 在这些组织中表达的中位值为截断值，将患者分为CCT4 高表达组和低表达组。使用survival 包(https：//cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)分析两组患者的总生存率。

1.1.3单因素和多因素Cox分析 剔除任意指标不全的患者，剩余235 例患者。使用survival 包(https：//cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)行单因素和多因素Cox分析。

1.1.4 临床相关性分析 剔除指标不全的患者，剩余370 例年龄信息齐全的患者，371 例性别信息齐全的患者，367 例分级信息齐全的患者，353 例TNM 分期信息齐全的患者，分析各指标与CCT4 的表达关系。

1.1.5 GSEA富集 使用GSEA 软件(software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)和全基因表达数据进行GSEA 富集分析。根据CCT4 表达中位值将患者分为高表达组和低表达组，比较两组患者的其他基因表达差异，根据KEGG 富集要求对差异表达基因进行通路富集。Nom p-val ＜0.05 和FDR q-val ≤0.25 视作有意义。

1.1.6 蛋白互作网络 检索数据库String (https：//string-db.org/)和，Genemania (http：//genemania.org/)以筛选人体内和CCT4的互作蛋白。String筛选的基因截断值为0.4，大于0.4 表示相关性较强。使用cytoscape 软件绘图。

1.2 临床样本

我们收集了2015 年-2019 年安徽医科大学附属第一医院肝胆胰外科收治的肝癌患者中的60 例肝细胞癌患者，所有病例经手术后病理资料证实为肝癌患者，对于临床资料的完善与否不作特殊性要求。另收取60 例取自远离癌组织中心5cm 以上的癌旁正常组织作为对照，所有患者术前均均未行放、化疗。选取2019 收集的肝癌组织中的15 例，经10%的中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，4μm 厚切片保存备用。

1.3 RNA 提取和qRT-PCR

根据Biotech RNA 提取试剂盒说明书提取60 对癌与癌旁组织的总RNA，并反转录成互补的脱氧核糖核酸（cDNA）。试用Nanodrop 2000 分光光度计（Thermo Scientific，美国）测量RNA 的浓度及纯度。使用SYBER Green I Master Mix 方案行qRT-PCR，反应体系为10μ L,反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 20s，40 个循环；95℃，5s，65℃，1min。CCT4 正向引物：5′-ATGCCCGAGAATGTGGCAC-3′；反向引物：5′-GCTTGTCGCGGTCCTGATAG-3′。使用β-actin 为内参，β-actin 正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；β-反向引物：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。

1.4 免疫组化

将组织切片脱蜡，水合，通过柠檬酸盐抗原修复溶液（用PBS 稀释）在微波条件下修复，CCT4 单克隆抗体（中国 Proteintech 公司，货号：21524-1-AP）以1 ∶100 稀释，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗(购买自美国Jakson 公司)以1 ∶200 的比例稀释。显微镜下拍照，观察肝脏组织中的CCT4 蛋白表达强度。

1.5 统计学分析

用Wilcox 秩和检验分析TCGA 数据库中CCT4 在不配对肝癌和正常组织中的差异表达。使用t检验分析qRT-PCR 检测的CCT4在配对癌和癌旁组织中表达。使用χ2检验分析TCGA 数据库中CCT4 表达水平与肝癌患者的临床病理特征关系；Log-Rank 法检验行单因素和多因素Cox分析。以P＜0.05表示具有统计学意义。

2.结果

2.1 CCT4 在肝癌中的表达水平

我们首先比较了CCT4 mRNA 在TCGA 数据库里374 个肝癌和50 个正常组织中的表达(图1A)，同时使用qRT-PCR 检测CCT4 mRNA 在60 例配对癌和癌旁组织中表达以验证TCGA 数据库结果(图1B)。结果表明,CCT4mRNA 在肝癌组织中的表达显著高于其在癌旁的表达(图1A/B)(P=1.085e-23,P＜0.001)。进一步，我们使用免疫组化检测CCT4 蛋白在15 例配对癌和癌旁组织中表达(图1C)。结果提示在癌组织中CCT4 蛋白表达较高。总之，CCT4 mRNA 和蛋白在癌组织中高表达。

图1 注：A.在TCGA 公共数据库中CCT4 在癌旁与肝癌组织中的表达差异；B.在60 对标本中CCT4 在癌旁和肝癌组织的表达差异；C.CCT4 在肝组织的免疫组织化学染色（左边配对癌旁组织，右边配对肝癌组织）

2.2 CCT4 在肝癌中的预后价值

为了探讨CCT4 在肝癌中的预后价值，我们使用Kaplan-Meier 法绘制了生存曲线，同时使用log-Rank 法行单因素和多因素cox 回归分析。如图2 所示，CCT4 高表达组患者的1 年-，3 年-和5 年总生存率分别约为75.1%，52.5%和41.7%；CCT4 低表达组患者的1 年-，3 年-和5 年总生存率分别约为89.7%，70.2%和53.6%。CCT4 高表达组患者的总生存率更低 (P=0.005)。见表1 所示，单因素Cox 分析结果提示TNM 分期 (HR[95%CI]=1.86[1.46 ～2.39]) (P＜0.01)、T 分 期 (HR[95%CI]=1.8[1.43 ～2.27]P＜0.01)、M 分 期(HR[95%CI]=3.85[1.21 ～12.28]P＜0.01) 及CCT4 表 达(HR[95%CI]=1.02[1.01 ～1.03]P＜0.01)与患者预后相关。多因素Cox 分析结果提示，CCT4 mRNA 表达（HR[95%CI]=1.02[1.01～1.03]P＜0.01）是肝癌患者的独立危险因素。总之，CCT4是肝癌独立不良预后因子。

图2 在TCGA 数据中CCT4 的表达与肝癌患者的生存分析

表1 TCGA 中CCT4 的单因素和多因素Cox 回归分析

2.3 CCT4 表达与患者临床病理特征的关系

如图3 所示，CCT4 表达与患者的性别无关。但是与患者的年龄(P＜0.022)、病理分级(P＜0.001)及TNM 分期呈正相关 (P＜0.001)。

图3 A.以中位值为界限将肝癌患者中不同的年龄分为高低两组，CCT4 的表达与年龄的相关性；B.根据肝癌患者的性别进行分组，CCT4 的表达与性别的相关性；C.CCT4 的表达与肝癌患者中不同病理分级的关系；D.CCT4 的表达与肝癌患者中不同的病理分期的关系

2.4 GSEA 富集分析结果

我们使用GSEA 软件对HCC 中CCT4 进行GSEA 富集分析,以探索CCT4 调控的基因集。我们分析了CCT4 对178 个富集通路的影响。如图4 所示分析结果提示与细胞周期及WNT 信号通路,MAPK信号通路和VEGF通路途径有关的基因组在CCT4的高表型中上调。

图4 示：使用GSEA 软件对CCT4 在肝癌中进行GSEA 富集分析,所得到的4个与癌症关系密切相关由CCT4 高表型所富集到的通路.

2.5 蛋白互作网络

我们检索了String 和Genemania 两个数据库以分析CCT4 在人体的互作蛋白。结果如图5 所示这些蛋白主要包括PFDN 复合物中多个亚基（PFDN1,PFDN2,PFDN4,PFDN5,PFDN6）及CDC20 蛋白,SPHK1 蛋白等。

图5 示：通过使用String,Genemania 两个数据库预测CCT4 的蛋白互作网络

3.讨论

CCT 复合物属于分子伴侣蛋白，其可通过折叠肌动蛋白及微管蛋白而参与细胞的分裂和迁移[12]。此外，在肿瘤中，CCT4 还可通过折叠癌基因或抑癌基因而调控肿瘤进展。这些基因包括VHL、P53、STAT3、cyclin E和CDC20等[6-10]。作为CCT家族的一员，CCT4 的丢失可抑制食道鳞状细胞癌的增殖、侵袭和迁移[11]。但是目前CCT4 在HCC 的作用仍不清楚。

本研究比较TCGA 数据库中CCT4 mRNA 在肝癌中的表达并通过qRT-PCR和免疫组化在肝癌患者标本中验证TCGA数据库结果，我们发现CCT4 在肝癌组织中高表达。进一步通过对TCGA 数据库中肝癌患者行生存分析、单因素和多因素回归分析，发现高表达的CCT4 的患者预后较差，且CCT4 是肝癌的独立预后因子。这提示CCT4 在肝癌中表达上调，且充当预后标志物。

此外我们通过蛋白互作网络及GSEA 富集分析初步讨论了CCT4 在肝癌中的潜在机制。GSEA 的结果表明细胞周期、VEGF 信号通路、MAPK 信号通路和Wnt 信号通路的相关基因在CCT4 高表型中表达上调。MAPK 信号通路通过多种级联反应发挥作用，MAPK/ERK 信号通路的异常激活在肝癌中发挥重要作用[12]。Wnt信号通路参与细胞增殖、存活、自我更新和分化等[13-14]。在肝癌中Wnt/β-catenin 信号通路的活化与肝癌的发生密切相关[15]。蛋白互作网络结果显示，CCT4 与PFDN 蛋白中的数个亚基互作。PFDN 亚基可以在HepG2 肝癌细胞中以高亲和力与癌基因HDAC1互作而促进肝癌细胞的增殖[16]。CDC20 是细胞周期调节中的关键分子[17]。chu 等研究表明CDC20 可能通过Wnt /β-catenin 信号传导通路促进皮肤鳞状细胞癌的发展[18]。综上CCT4 可通过与PFND 的亚基及CDC20 互作而参与调控肝癌进展。

但是，我们的研究仍然存在一些局限性。（1）组化样本不足。（2）没做细胞功能学和裸鼠体内实验。（3）未验证GSEA 富集和蛋白互作网络所得出的结果。这些不足正是我们下一步的研究重点。尽管存在局限性，我们的研究表明CCT4 是肝癌预后有价值的标志物.