2-氨基咪唑衍生物的合成及其细菌生物膜抑制活性研究

杨琼敏 程铖 杨果 杨元勇（通讯作者）

（1 贵州医科大学药学院 贵州 贵阳 550025）

（2 安顺市妇幼保健院 贵州 安顺 561000）

细菌生物膜（Bacterial biofilms，BF）是由细菌分泌的核酸、蛋白质以及多聚糖等组成的胞外聚合物[1]。研究表明，生物膜为成熟细菌提供保护[2]，是细菌耐药的最主要原因，由于生物膜的存在使得细菌耐药性增加10 ～1000 倍。细菌耐药性是目前全球面对的严峻问题，基于此，通过抑制细菌生物膜从而降低细菌耐药性的产生是一种全新的抗菌策略[3]。此外，由于生物膜对游离细菌的保护作用，导致细菌感染难以治愈并且有反复感染的可能[4]。

在生物膜形成过程中，细菌群体感应（Quorum-Sensing，QS）系统起着至关重要的作用[5]。群体感应现象是细菌之间信息传递的一种方式，即细菌能自发产生、释放特定的化学物质进入环境中，当浓度达到一定阈值后，即可启动相应基因的表达对群体行为进行调控的一种现象[6]。这种化学物质被称为细菌的自诱导物(Autoinducer，AI)。QS 不仅能够调控生物膜的形成，而且能够调控细菌的多种生物学功能如毒力产生、生物荧光、致病基因的表达等[7,8]。

由此可见，群体感应系统在生物膜形成中起着至关重要的作用。近期研究表明，通过外加小分子化合物或者酶以干预或猝灭信号分子，从而干扰群体感应系统可以有效降低生物膜的形成。具体方法是通过化学合成自诱导剂结构特性相类似物，这些化合物能竞争性的与自诱导剂受体蛋白相结合，从而抑制生物膜的形成[9,10]。

本文旨在合成根据革兰氏阴性菌自诱导物结构特性从而合成出其结构类似物，用于测定对于A.bauman Ⅱ、E.coli和P.Aeruginosa 三类菌株BF 的抑制情况，为以后的抗菌药物研究提供理论参考。

1.资料与方法

1.1 实验仪器与试剂

紫外—可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；酵母提取液（生工生物工程（上海）股份有限公司）；胰化蛋白胨（生工生物工程（上海）股份有限公司）；结晶紫（阿达玛斯试剂有限公司）；36%乙酸溶液（天津市富宇精细化工有限公司）；95%乙醇溶液（天津市富宇精细化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 目标化合物的合成 在250mL 圆底烧瓶中依次加入1.08g2-氨基咪唑原料（5m mol），1.07mL 氯甲酸苄酯原料（5mmol），再加入Et3N（5mmol）作为碱，DCM5.00mL 作为溶剂，室温反应8h，经薄层色谱法检测（石油醚∶乙酸乙酯=1 ∶1），确认反应结束后，用乙酸乙酯萃取三次，有机相用Na2SO4 干燥，静置，抽虑，用旋转蒸发仪蒸干，得白色粉末，后用乙酸乙酯和水进行重结晶，过滤得纯品。共计合成出9 个化合物，结构如图1。

图1

1.2.2 活性测试 使用96 孔聚苯乙烯板构建生物膜，测定其形成能力。在96 孔板中，每孔加入190μL 菌液和10μL 上述合成的化合物溶液，每个样品平行测定8 孔，通过调节OD600值使菌液浓度达到106C FU/mL，并将化合物终浓度调节至100mol/L。其中鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ S1 △abaI）仅为正常鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ）缺失一段abaI 基因，因此将鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ S1 △abaI）仅仅设置为正常鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ）中的阴性对照。在37℃恒温培养箱中静止培养24h。

培养24h 后，将96 孔板中菌液吸出，用双蒸水反复冲洗两次（200μL/孔），以去除浮游菌；将双蒸水吸出，加入95%乙醇溶液（200μL/孔），固定生物膜30min；将固定液去除，自然风干后，加入1%结晶紫染液（200μL/孔），在室温下染色10min；丢弃染液，用流水把多余的染液冲洗干净；并室温凉干或在37 ℃烘箱中烘干；完全干燥后，加入36%乙酸溶液（200 μL/孔），在电热恒温培养箱中以37 ℃作用30 min 以溶解结晶紫；在570nm 单波长条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的OD 值。

2.结果

每个化合物和每种菌株均为8 个复孔，将最终读数去掉最高值和最低值，计算平均值和标准差。以未加目标化合物，以10μ L D M S O 溶液代替的菌液作为空白对照。其中，将缺失一段abaI 基因的鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ S1 △a b a I）不加目标化合物，设置为正常鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ）中的空白对照。9 种化合物对鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ）、铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa ATCC 27853）、大肠杆菌（E.coli DH5α）生物膜抑制活性测试结果见图2-4。

图2 鲍曼不动杆菌生物膜OD 值Fig.2 OD value of Acinetobacter baumann Ⅱ biofilm

图3 铜绿假单胞菌生物膜OD 值Fig.3 OD value of Pseudomonas aeruginosa biofilm

图4 大肠杆菌生物膜OD 值Fig.4 OD value of E.coli biofilm

3.讨论

在鲍曼不动杆菌（A.baumann Ⅱ）生物膜抑制活性测试中，这一种细菌BF 九个目标化合物均对其生物膜有抑制作用，其中化合物Ⅴ（N-（1H-咪唑-2-基）十二酰胺）具有较强抑制活性，与其他化合物相比，直连烷烃的效果较好，且12 个碳原子效果最佳。后期研究将以此作为指导进行下一步结构改造。

铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa ATCC 27853）生物膜形成能力测试中，九个目标化合物中仅有一个化合物对其生物膜有抑制作用，且活性偏低，基本可认为无抑制作用。需要合成更多具有与AHLs 相似具有亲水亲脂基团的化合物，进行BF 抑制活性测试。

大肠杆菌（E.coli DH5α）是生活中极为常见的细菌，在本次生物膜抑制活性测试中，九个目标化合物均对其有较好的抑制作用，且抑制程度相近，其具体应用还有待进一步的研究。

本次研究提供了数个具有活性的生物膜抑制剂，主要意义在于希望为后续的抗菌药物研发提供理论参考，以及为新型抗菌药物研发提供候选化合物。