三相萃取法分离纯化竹黄多糖工艺优化*

朱 炜，俞婷婷，计玮玮，黄 玲，钮为民**

（1.湖州市生态林业保护研究中心，浙江 湖州 313000；2.湖州市梁希森林公园管理处，浙江 湖州 313000；3.湖州市国营林场，浙江 湖州 313000）

竹黄菌（Shiraia bambusicola P.Henn.）又名竹花、竹赤团子、竹三七、竹茧等，是一种寄生于竹子细嫩枝杆上的子囊菌[1]，其子座竹黄为传统中药，具有止咳祛痛、舒筋活络、祛风利湿、补中益气、活血补血、散瘀通经等功效[2]。竹黄菌主要分布于我国南部的江西、浙江、四川、湖南、安徽、贵州、福建、云南等地区[3]。竹黄多糖是竹黄的有效成分之一，近年来研究表明竹黄多糖具有良好的抗氧化性能和清除自由基能力，对小鼠的四氯化碳急性肝损伤具有保护作用，具有良好的开发利用价值[4]。

目前，多糖的传统提取工艺为乙醇沉淀法，此方法虽然能提取出大量的多糖，但是存在提取不彻底、原料利用率低、乙醇用量大等问题[5]。三相萃取法原理是通过在粗提液中加入无机盐和有机溶剂使其形成三相，上相为有机层，主要提取色素、脂类等极性较小的物质；中间相为蛋白质提取层；下相为水层，主要提取一些水溶性物质[6]。此外，体系中无机盐和有机溶剂都可回收，且具有操作简单、高效、体系容量大、可连续操作、条件温和等特点[7-8]。三相分离法应用了传统盐析、共溶剂、等离子体和蛋白质渗透沉淀等多种原理，最近几年才被用到多糖的分离纯化中[9-10]。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

竹黄子实体采自浙江省湖州市梅峰镇短穗竹上；苯酚、硫酸、葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、亚硝酸铝、无水乙醇、（NH4）2SO4、叔丁醇均为国产分析醇，购自国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白购于上海索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器

R-201旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司；20B型中药粉碎机，南京邦斯特制药设备有限公司；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DKZ-2型电热恒温振荡水槽，上海福玛实验设备有限公司；PL602-S电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-2600紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 竹黄多糖提取液的制备

将10 g干燥的竹黄子实体粉碎后过40目筛，按料液比1∶40（g·mL-1）加入蒸馏水，90℃下水浴搅拌提取60 min；连续提取2次，过滤，合并2次滤液，滤液经50℃、真空旋转蒸发仪浓缩至200 mL；浓缩液供三相萃取法分离多糖使用。

1.3.2 三相萃取体系

参照Yan等[10]的方法，取10 mL食用菌水提取浓缩液加入一定量的（NH4）2SO4，然后加入一定体积的叔丁醇配制所需三相体系。磁力搅拌10 min使两相充分混匀，调节pH，以5 000 r·min-1离心10 min加速萃取剂分离过程，于一定温度下静置60 min，上相主要为叔丁醇，含有一些色素等杂质；中间相主要为蛋白质；下相主要是（NH4）2SO4和竹黄多糖[10]。使用移液器将三相各层的溶液分别吸出存于微量量筒中测定体积，后用水稀释各相溶液，上相、中间相、下相检测指标为蛋白质和多糖浓度。

1.3.3 萃取条件的单因素试验

1）（NH4）2SO4添加量的确定

取5组各10 mL提取浓缩液，分别加入（NH4）2SO4使其质量浓度为10%、20%、30%、40%、50%后，再各加入15 mL叔丁醇（叔丁醇∶样液体积比为1.5∶1）；在萃取温度为25℃，pH 6的条件下萃取60 min；静置2 h形成三相后，测定各相的相应指标，考察不同（NH4）2SO4质量分数对体系中多糖萃取率与蛋白质去除率的影响。

2）叔丁醇与样液体积比的确定

吸取10 mL提取浓缩液于5组试管中，分别加入20%质量分数的（NH4）2SO4后，加入不同体积叔丁醇 （0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1）；在萃取温度为25℃，pH 6的条件下萃取60 min，静置2 h形成三相后，测定各相的相应指标；考察不同体积叔丁醇对体系中多糖萃取率与蛋白质去除率的影响。

3）萃取温度的确定

吸取10 mL提取浓缩液于5组试管中，加入（NH4）2SO4，使其质量浓度为20%后加入15 mL的叔丁醇（叔丁醇∶样液体积比为1.5∶1），在萃取温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH 6的条件下萃取60 min后测定各相的相应指标，考察不同萃取温度对体系中多糖萃取率与蛋白质去除率的影响。

1.3.4 响应面法分析试验

选择萃取温度、叔丁醇添加量、（NH4）2SO4质量分数3个因素所确定的水平范围。运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用3因素3水平的响应面设计。利用Design Expert 8.05软件对试验数据进行回归分析。自变量的试验水平分别以-1，0，1进行编码，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面分析因子及水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 分析方法

1）多糖萃取率的测定

采用苯酚-硫酸比色法[11]，制作葡萄糖标准曲线，在490 nm处测定样品吸光度，通过纯化前后样品中多糖含量来确定多糖萃取率（M，%），计算公式为：

式中：C1为纯化后提取液中多糖含量（g）；C2粗提液中多糖含量（g）。

2）蛋白质去除率的测定

采用考马斯亮蓝比色法[12]，制作牛血清蛋白标准曲线，在595 nm处测定样品吸光度，通过纯化前后样品中蛋白质含量来确定蛋白质去除率（N，%），计算公式为：

式中：M1为纯化后提取液中蛋白质含量（g）；M2粗提液中蛋白质含量（g）。

3） 数据处理

利用Design Expert 8.05软件进行数据分析和处理[13]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 （NH4）2SO4质量分数对竹黄多糖萃取率和蛋白质去除率的影响

（NH4）2SO4质量分数对多糖萃取率及蛋白质去除率的影响见图1。

由图1可知，随着（NH4）2SO4添加量从10%增加到20%，多糖的萃取率增加，当（NH4）2SO4添加量为20%时，多糖的萃取率最大为87.50%。这可能是由于NH4+和SO42-可以稳定大分子间的相互作用，使萃取体系更加稳定，多糖能更好地溶解在溶剂中[10]；当（NH4）2SO4添加量超过20%，竹黄多糖的萃取量呈减少趋势，可能由于盐浓度过高会使多糖和水分子之间的氢键作用力被减弱，从而降低了多糖的萃取率。同时，随着提取液中（NH4）2SO4添加量的增加，蛋白质去除率呈先上升后下降趋势。在较低盐浓度范围内蛋白质去除率上升缓慢，当（NH4）2SO4添加量到达20%时，蛋白质去除率最高为84.81%，盐离子在较低浓度时的“盐溶”效应对相的分离有一定的促进作用；然而，随着提取液中（NH4）2SO4添加量继续增加，水分子被盐离子吸引，从而产生强烈的盐析效应[14]。因此提取液中最适（NH4）2SO4质量分数为 20%。

2.1.2 叔丁醇与样液体积比对竹黄多糖萃取率及蛋白质去除率的影响

叔丁醇与样液体积比对竹黄多糖萃取率及蛋白质去除率的影响见图2。

由图2可知，随着叔丁醇添加量的增加，竹黄多糖的萃取率也相应增加，当叔丁醇与样液体积比为0.5～1.0时，竹黄多糖萃取率增加幅度较大，在叔丁醇与样液体积比为1∶1时竹黄多糖的萃取率最大为84.32%。这可能是增加的叔丁醇和（NH4）2SO4相互作用的结果，使多糖萃取率增加；但是当叔丁醇与样液体积比超过1.0后，竹黄多糖的萃取率大幅下降，这可能是叔丁醇的含量过高不利于三相体系的稳定；可溶性蛋白质去除率随叔丁醇的添加量增加而逐渐下降[15]，因此提取液中最适叔丁醇∶样液体积比为 1∶1。

2.1.3 萃取温度对竹黄多糖萃取率的影响

萃取温度对竹黄多糖萃取率及蛋白质去除率的影响见图3。

由图3可知，当竹黄多糖萃取温度自20℃升高至40℃，竹黄多糖的萃取率逐渐增大至83.70%，这可能是因为随着温度的升高大量的羟基暴露促进了更多的氢键或链接形成。三相萃取溶液体系中分子热运动加快，从而使多糖的亲水性增强，这样竹黄多糖更容易从食用菌中进入到萃取溶液中，从而竹黄多糖的萃取率增加；当萃取温超过40℃以后，竹黄多糖的萃取率出现下降。同时，随着萃取温度的增加，蛋白质去除率呈先上升后下降趋势。当温度为30℃时蛋白质萃取率最大为73.10%，因此综合考虑选择萃取温度为40℃为宜。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面分析试验。选择萃取温度（A）、叔丁醇与样液体积比（B）、（NH4）2SO4质量分数（C）作为自变量，以竹黄多糖萃取率作为响应值设计响应面试验，结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及试验结果Tab.2 Experiment design and results of response surface analysis

利用Design Expert 8.05软件对表2试验数据进行分析[13]，获得多糖萃取率对萃取温度、叔丁醇与样液体积比和（NH4）2SO4质量分数的多元二次回归方程，确定以多糖萃取率（P，%）为目标函数的二次多项回归模型为：

对上述方程进行方差分析，见表3。

表3 回归模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

由表3可知，以多糖萃取率为目标函数的回归方程的回归效果达到极显著水平，P＜0.000 1；模型的决定系数R2为0.987 9，说明模型与实际试验拟合较好；校正决定系数R2adj为0.972 4，说明该模型能解释97.24%响应值的变化；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表3中模型失拟项的P=0.333 6＞0.05，表明模型的失拟项不显著；根据表3的显著性分析结果，叔丁醇添加量、萃取温度对响应值影响显著 （P＜0.05），（NH4）2SO4质量分数（C）、A2、B2、C2以及AC、BC的交互项对多糖萃取率的影响极显著（P＜0.01）。各个因素对多糖萃取率影响大小顺序依次为：（NH4）2SO4质量分数＞叔丁醇与样液体积比＞萃取温度。

2.2.2 响应面图形分析

根据回归方程作响应曲面图，并根据拟合的响应曲面形状，探讨萃取温度、叔丁醇添加量及（NH4）2SO4质量分数对竹黄多糖萃取率的影响。分别将萃取温度、叔丁醇添加量及（NH4）2SO4质量分数的其中一个因素固定在0水平，得到另外2个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线见图4～图6。

从图4～图6可以看出，影响竹黄子实体多糖萃取率的最显著因素为（NH4）2SO4质量分数，极值条件应该在等高线的圆心处，表现为响应面变化弧度较大。其次是叔丁醇与样液体积比。萃取温度响应面弧度变化平缓，说明其对响应值影响较小。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反[16]。从图4～图6可以看出，叔丁醇与样液体积比与（NH4）2SO4质量分数相互之间，萃取温度与（NH4）2SO4质量分数相互之间对多糖萃取率有交互作用的影响。

2.3 验证试验

根据Box-Behnken试验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design-Expert 8.05分析，得到最佳提取条件为：萃取温度35.16℃，叔丁醇∶样液体积比为0.96∶1，（NH4）2SO4质量分数26.10%，多糖萃取率理论值可达93.51%。

为检验模型预测值与实际试验值之间的相关性，即检验响应面优化模型的可靠性，对竹黄子实体中多糖萃取率进行试验验证。试验中萃取温度、叔丁醇∶样液体积比和（NH4）2SO4质量分数的优化值分别为35.16℃，0.96∶1，26.10%。通过3次平行试验，测得多糖萃取率分别为90.38%、90.25%、90.67%。实际多糖萃取率平均值为90.43%，达到了回归模型预测理论值的96.70%。试验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测竹黄子实体多糖萃取率。

3 结论

以竹黄为原料进行试验，利用三相萃取法分离纯化竹黄多糖，考察叔丁醇-（NH4）2SO4-水提液体系的三相萃取性质，研究了三相体系中的提取液中（NH4）2SO4质量分数、叔丁醇添加量、萃取液温度对竹黄提取液中多糖萃取率和蛋白质去除率的影响；在单因素试验的基础上，通过Box-Benhnken组合设计和响应曲面分析法优化了三相萃取的最优工艺。响应面分析结果表明，竹黄子实体中多糖的最佳提取条件为：萃取温度35.16℃，叔丁醇∶样液（体积）为0.96∶1，（NH4）2SO4质量分数26.10%，此条件下的多糖萃取率可得90.43%，蛋白质去除率可达88.45%。三相萃取体系中的无机盐和有机溶剂都可以回收重复使用，三相萃取法分离纯化竹黄活性成分是一种具有前景的高效分离方法。