测定保健食品中氨基葡萄糖和硫酸软骨素的2种高效液相色谱法对比

(河南医学高等专科学校药学系化学教研室,郑州 451191)

氨基葡萄糖是人体软骨中糖胺聚糖和透明质酸的主要成分,能够促进软骨基质的重建,延缓骨关节炎的发病进程。硫酸软骨素是关节软骨的基本组成物质,有助于促进骨钙沉积、帮助新骨形成,硫酸软骨素与氨基葡萄糖结合使用能有效地保护及修复关节软骨[1]。随着人们生活水平的提高,公众的健康意识和健康需求也不断增强,氨基葡萄糖和硫酸软骨素添加类保健食品也越来越受到中老年人的青睐。氨基葡萄糖和硫酸软骨素预防与修复关节炎的药效与其含量相关,含量不达标时会影响其保健效果[2]。因此,在氨基葡萄糖和硫酸软骨素添加类保健食品的研制与生产过程中,需严格保证氨基葡萄糖和硫酸软骨素的添加量。

文献[3]采用分光光度法测定了氨基葡萄糖与硫酸软骨素含量。文献[4]采用分光光度法测定复方硫酸软骨素片中硫酸软骨素含量。与化学分析法相比,高效液相色谱法更为灵敏、快速、准确。文献[5]采用C18色谱柱和紫外检测器,建立了测定硫酸软骨素和氨基葡萄糖含量的高效液相色谱法,目标物保留时间约为2 min,不利于复杂样品的分析。文献[6]采用C18色谱柱,蒸发光散射检测器,高效液相色谱法测定了硫酸软骨素。文献[7]使用强阴离子交换硅胶柱,采用高效液相色谱法测定复方盐酸氨基葡萄糖硫酸软骨素片中硫酸软骨素的含量。现行国家标准GB/T 20365－2006《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定液相色谱法》采用C18色谱柱测定氨基葡萄糖与硫酸软骨素。氨基葡萄糖与硫酸软骨素在烷基色谱柱上不易保留,出峰时间在2 min左右,接近于死时间,易产生与杂质共流出的现象;氨基葡萄糖与硫酸软骨素在C18色谱柱上的分离度小于1.5,这影响定量结果的准确性;所选择的192 nm 紫外检测波长不具有特异性,样品中杂质组分和流动相在该检测波长处易产生紫外吸收,造成紫外检测器的基线升高,过高的噪声信号影响测定结果的准确性。色谱柱和检测器的选择对于提高液相色谱法的灵敏度、选择性及分析结果的准确性具有重要的意义[8]。本工作分别采用C18色谱柱和紫外检测器,氨基色谱柱和蒸发光散射检测器,建立了2种高效液相色谱法测定保健食品中氨基葡萄糖与硫酸软骨素,系统化研究了色谱柱和检测器对高效液相色谱法(HPLC)测定保健食品中氨基葡萄糖和硫酸软骨素的影响。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Alliance 2695型高效液相色谱仪,配蒸发光散射检测器(ELSD)和紫外检测器(UV);Solaris XE型氮气发生器;CT15RE型高速离心机。

氨基葡萄糖标准储备溶液:5.00 g·L－1,称取0.500 g的氨基葡萄糖于100 mL 容量瓶中,用流动相定容,于4 ℃冰箱保存。

硫酸软骨素标准储备溶液:3.00 g·L－1,称取0.300 g的硫酸软骨素于100 mL 容量瓶中,用流动相定容,于4 ℃冰箱保存。

D-(＋)-氨基葡萄糖盐酸盐的纯度不小于99%;硫酸软骨素标准品的纯度不小于99%;庚烷磺酸钠的纯度大于98.0%;乙腈为色谱纯;其余试剂均为分析纯;试验用水为超纯水,符合国家标准(GB/T 6682－2008)的要求。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件(氨基色谱柱和蒸发光散射检测器) NH2P-50-4E氨基色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温40 ℃;流动相为0.1%(体积分数)三氟乙酸溶液与乙腈以体积比95∶5组成的混合液;氮气压力3.10×105Pa;加热器级别75%;漂移管温度70 ℃;蒸发光散射检测器的增益值80;进样体积10μL;流量1.0 mL·min－1。

2)色谱条件(C18色谱柱和紫外检测器) Symmetry C18烷基色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温30 ℃;流动相为10 mmol·L－1庚烷磺酸钠溶液与乙腈以体积比95∶5组成的混合液;检测波长195 nm;进样体积10μL;流量1.0 mL·min－1。

1.3 试验方法

保健食品样品研磨并混匀后称取100 mg置于锥形瓶中,加10 mL 乙腈和10 mL 水,振荡混合后超声提取20 min,以6 000 r·min－1转速离心,取上清液。按照上述程序重复超声提取3次,上清液合并后转移至50 mL容量瓶中,用流动相定容后混合均匀,经0.45μm 滤膜净化后按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-ELSD的建立

按色谱条件(氨基色谱柱和蒸发光散射检测器)对氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液进行测定,其色谱图见图1。

图1 氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液的色谱图(蒸发光散射检测器)Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate(ELSD)

由图1可知:氨基葡萄糖和硫酸软骨素的色谱峰呈正态分布,氨基葡萄糖和硫酸软骨素在该色谱体系的分离度大于1.5,氨基葡萄糖和硫酸软骨素的色谱峰相互之间没有干扰。

按试验方法(HPLC-ELSD)对保健食品样品进行分析,其色谱图见图2。

图2 保健食品样品的色谱图(蒸发光散射检测器)Fig.2 Chromatogram of the sample of health food(ELSD)

由图2可知:在10 min内,保健食品样品中的氨基葡萄糖和硫酸软骨素与杂质得到了基线分离,保健食品样品中硫酸软骨素和氨基葡萄糖的出峰时间与混合标准溶液中硫酸软骨素和氨基葡萄糖的出峰时间基本一致(相对偏差＜1.0%)。

2.2 HPLC-UV的建立

按色谱条件(C18色谱柱和紫外检测器)对氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液进行测定,其色谱图见图3。

由图3可知:氨基葡萄糖和硫酸软骨素的保留时间分别为2.27,1.83 min,氨基葡萄糖和硫酸软骨素的分离度小于1.5。

图3 氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液的色谱图(紫外检测器)Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate(UV)

氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液的紫外光谱见图4。

由图4可知:随着检测波长的增加,氨基葡萄糖和硫酸软骨素的紫外吸收逐渐降低。试验选择检测波长为195 nm。

2.3 标准曲线和检出限

分别移取适量的5.00 g·L－1氨基葡萄糖标准储备溶液和3.00 g·L－1硫酸软骨素标准储备溶液于100 mL容量瓶中,用流动相定容,得到混合标准溶液系列。混合标准溶液系列中氨基葡萄糖的质量浓度依次为20.0,40.0,80.0,150.0,300.0 mg·L－1,硫酸软骨素的质量浓度依次为50.0,100.0,200.0,300.0,500.0 mg·L－1。按仪器工作条件对上述氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液系列进行测定。

图4 氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液的紫外光谱Fig.4 UV spectra of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate

HPLC-ELSD 采用液相色谱工作站处理软件Ln～Ln双对数方程拟合氨基葡萄糖和硫酸软骨素的质量浓度和色谱峰面积,拟合时要求相关系数的平方大于0.995 0,得到氨基葡萄糖和硫酸软骨素的线性范围并生成标准曲线的线性回归方程、相关系数,结果见表1。在线性范围内,蒸发光散射检测器响应值的自然对数与氨基葡萄糖和硫酸软骨素质量浓度的常用对数呈线性关系。线性回归方程中,x是质量浓度的自然对数,y是色谱峰面积的自然对数。

HPLC-UV 以氨基葡萄糖和硫酸软骨素的质量浓度为横坐标,对应的色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。氨基葡萄糖和硫酸软骨素的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),结果见表1。

表1 线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限Tab.1 Linearity ranges,linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

2.4 方法的精密度

在空白保健食品样品中加入100.0 mg·L－1氨基葡萄糖和硫酸软骨素混合标准溶液,按试验方法进行分析,平行测定7次,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

由表2可知:RSD 小于1.5%。

2.5 两种色谱方法的对比

氨基葡萄糖和硫酸软骨素的极性较强,现行国家标准中采用反相C18柱色谱法,极性较大的化合物在弱极性的烷基柱中几乎不保留,目标峰出现在2 min左右,保留时间接近于色谱柱死时间。文献[9-10]也注意到氨基葡萄糖在烷基柱上的弱保留的问题,过短的保留时间会导致待测组分和样品杂质发生共流出现象,待测组分峰受到溶剂峰及杂质峰的干扰,影响测定结果的可靠性与准确性。试验采用中等极性的氨基色谱柱,调整有机相与水相的比例,可以控制氨基葡萄糖和硫酸软骨素在色谱柱上的保留时间,避免了色谱保留时间过短所引起的杂质共流出的问题。在样品分析过程中通过调整流动相比例,使氨基葡萄糖和硫酸软骨素达到完全分离(分离度大于1.5)。

表2 精密度试验结果(n＝7)Tab.2 Results of test for precision(n＝7)

氨基葡萄糖和硫酸软骨素没有强的发光基团和特征紫外-可见吸收波长,紫外光吸收强度低,液相色谱法常选择近紫外区190 nm 为检测波长。受溶剂截止波长的限制,190 nm 紫外波长会引起严重的基线漂移,同时杂质组分在近紫外区易产生紫外光吸收,降低了测定结果的重现性。与紫外检测器不同,蒸发光散射检测器是通用型检测器,样品中的基质和流动相溶剂对检测信号几乎无噪声干扰。对于存在干扰基质的保健食品,蒸发光散射检测器比紫外检测器的抗干扰能力更强,定量结果更为准确可靠。

将2种高效液相色谱法应用于保健食品中氨基葡萄糖和硫酸软骨素的测定,并按试验方法对上述样品进行加标回收试验,样品分析结果见表3。

表3 样品分析结果(n＝7)Tab.3 Analytical results of the samples(n＝7)

由表3可知:HPLC-ELSD 的测定结果较为准确,而HPLC-UV 由于保留时间过短,无法排除杂质的干扰,测定结果和已知值出现较大的偏差;在有干扰杂质存在下,HPLC-ELSD 的回收率比HPLCUV 的回收率高。回收率和RSD 的测定结果表明:在分析复杂样品时HPLC-ELSD 的精密度和准确度更为可靠。

本工作研究了C18色谱柱和氨基色谱柱,紫外检测器和蒸发光散射检测器对高效液相色谱法测定保健食品中氨基葡萄糖和硫酸软骨素的影响。保健食品中氨基葡萄糖和硫酸软骨素的质量分数一般在10%以上,若保健食品的基质比较简单,则两种方法均可以快速、准确地测定氨基葡萄糖和硫酸软骨素的含量。与采用C18色谱柱和紫外检测器的高效液相色谱法相比,采用氨基色谱柱和蒸发光散射检测器建立的高效液相色谱法对保健食品中氨基葡萄糖和硫酸软骨素的分离度更好,测定灵敏度、重现性和准确度更高,适用于复杂样品中氨基葡萄糖和硫酸软骨素的同时测定。