高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中紫杉醇和三尖杉宁碱

(福建省食品药品质量检验研究院,福州 350001)

红豆杉为我国一级保护树种,红豆杉提取物紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用机制[1-3],是临床应用中最为优秀的天然抗肿瘤药物[4-6]。但红豆杉本身毒性很大,其茎、枝、叶、果、根均含毒性成分,有毒化合物包括紫杉碱、紫杉醇等。在没有医生的指导下,长期大量食用红豆杉,将引起中毒,主要表现为头昏、瞳孔放大、恶心、呕吐、弥散性腹痛、肌无力等症状,严重者出现心率过缓、心脏骤停或死亡等[7-9]。《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》(卫法监发[2002]51号)[10]中,已将红豆杉列入《保健食品禁用物品名单》,禁止红豆杉作为保健食品和食品原料使用。2006年卫生部发布第2号公告[11],严禁食品生产经营单位生产和经营含红豆杉的食品。但由于红豆杉的抗癌特性在民间有较高的知名度,市场上仍存在违法生产销售以红豆杉为原料的相关食品情况[12-13],最常见的是以红豆杉果为原料,白酒为酒基,制作的所谓红豆杉酒、红豆杉保健酒,在一些网络销售平台进行售卖。

目前我国还未建立任何食品中非法添加红豆杉的测定方法和标准,致使市场监管部门在查处相关案件时缺乏权威测定技术支持。本工作从确定红豆杉在白酒中的特征成分入手,建立了高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中红豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉宁碱的方法,并应用所建立的方法对网售红豆杉酒和市场上其他植物类保健酒、配制酒进行测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

API 4000Q 型高效液相色谱-串联质谱仪1(用于确定红豆杉的特征成分);ACQUITY UPLC ICLASS/XEVO TQ-S型高效液相色谱-串联质谱仪2(用于定量分析);Milli-Q IQ 7000型纯水系统;CR 21N 型高速冷冻离心机。

紫杉醇和三尖杉宁碱标准储备溶液:1 000 mg·L－1,分别称取紫杉醇和三尖杉宁碱对照品约10 mg,用适量甲醇溶解,并用甲醇定容于10 mL容量瓶中,于4 ℃保存。

紫杉醇对照品的纯度大于98.0%;三尖杉宁碱对照品的纯度为97.0%;甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯;试验用水为纯净水。

1.2 仪器工作条件

1)质谱条件(用于确定红豆杉的特征成分)电喷雾离子源(ESI),正离子模式;离子源温度450 ℃;全扫描模式,扫描范围质荷比(m/z)为100～500,500～1 000;电喷雾电压4 500 V;气帘气压力1.72×105Pa,雾化气压力3.79×105Pa,辅助气压力3.79×105Pa;分辨率2 000。

2)色谱条件(用于定量分析) ACQUITY UPLC R BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),柱温30 ℃;流量0.2 mL·min－1;进样量1μL。流动相:A 为甲醇,B 为水。梯度洗脱程序:0～1.00 min时,A 为70%;1.00～3.00 min时,A 由70%升至90%,保持1.00 min;4.00～4.01 min时,A 由90%降至70%,保持1.99 min。

3)质谱条件(用于定量分析) 电喷雾离子源,正离子模式;离子源温度150 ℃;毛细管电压2.76 k V;脱溶剂气温度500 ℃,脱溶剂气流量950 L·h－1;多反应监测(MRM)模式。其余质谱参数见表1,其中,“∗”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 红豆杉果酒的制备

红豆杉采自某镇红豆杉林(海拔800 m),摘下果子备用。白酒购于某超市。

将100 g红豆杉果实(保持果实原有形状)加入300 mL 53°白酒中放置于白酒原包装瓶中,常温保存3个月。

1.3.2 红豆杉果酒中化学成分分析

取上述自制的红豆杉果酒,用蠕动泵以流动注射方式注入高效液相色谱-串联质谱仪1的质谱仪中进行扫描。

通过得到的总离子流色谱图选取可能含有的目标成分(紫杉醇和三尖杉宁碱)的母离子,再对母离子施加一定的碰撞电压,使其产生特定的子离子,通过分析质谱碎片信息,确定含有的特征成分。

1.3.3 特征成分的测定

红豆杉酒(红豆杉果酒、红豆杉树皮酒)为自制和某网络平台购买,其他植物保健酒和植物配制酒来自市场抽检样品。

称取2.00 g红豆杉酒样品于100 mL 容量瓶中,用70%(体积分数,下同)甲醇溶液定容,摇匀,以8 000 r·min－1转速离心10 min,取上清液注入高效液相色谱-串联质谱仪2,按仪器工作条件进行测定(定量分析)。

2 结果与讨论

2.1 红豆杉特征成分的选择

根据文献[14-16],从红豆杉中可分离得到紫杉烷类、黄酮类等化合物,推测白酒浸泡红豆杉样品中也可能含有上述物质。一些紫杉烷类化合物具有抗癌活性和细胞毒性[17],作为目标物更有利于食品中违法添加行为的执法定性,许多红豆杉分离得到的黄酮类化合物在其他植物提取物中也同样存在。试验选择红豆杉紫杉烷类化合物中含量较多的紫杉醇和三尖杉宁碱作为红豆杉的特征成分的考察对象。

根据网售红豆杉酒制作方法的前期调研结果,模拟红豆杉酒制作方法自制红豆杉果酒,将自制红豆杉果酒直接注入质谱仪,分析得到质谱碎片信息,红豆杉果酒中特征成分的分析结果见表2。

表2 红豆杉果酒中特征成分的分析结果Tab.2 Analytical results of characteristic components in Taxus fruit wine

由表2可知:红豆杉果酒中含有紫杉醇和三尖杉宁碱。试验选择紫杉醇和三尖杉宁碱作为白酒中红豆杉的特征成分。

2.2 色谱行为

按仪器工作条件对紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液进行测定,其多反应监测色谱图见图1。

按试验方法对自制的红豆杉果酒样品进行分析,其多反应监测色谱图见图2。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱

紫杉醇和三尖杉宁碱极性较弱,在含有弱极性或非极性固定相的反相色谱柱中均有较好的保留。试验考察了紫杉醇和三尖杉宁碱在ZORBAX Elicpse Plus C8Rapid Resolution HD 色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm)和ACQUITY UPLC R BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)上的保留情况。结果表明:目标物在ACQUITY UPLC R BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)上出峰峰形较好,无杂质干扰,响应值较高。试验选用ACQUITY UPLC R BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)。

图1 紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液的多反应监测色谱图Fig.1 MRM chromatograms of mixted standard solution of taxol and cephalomannine

图2 红豆杉果酒样品的多反应监测色谱图Fig.2 MRM chromatograms of the sample of Taxus fruit wine

2.3.2 流动相

试验分别考察了以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等体系为流动相时紫杉醇和三尖杉宁碱的响应情况。结果表明:上述体系作为流动相时,紫杉醇和三尖杉宁碱的峰形都较好,但甲醇-水体系作为流动相时,紫杉醇和三尖杉宁碱的响应值最高。试验选择流动相为甲醇-水体系。

2.4 质谱条件的选择

将50.0μg·L－1紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液以针泵进样方式注入高效液相色谱-串联质谱仪2,在正离子模式下进行全扫描,紫杉醇及三尖杉宁碱形成母离子峰,m/z分别为876.1,854.1。然后施加一定的碰撞电压进行子离子扫描,选取信号最强的2个子离子分别作为定性和定量离子,优化碎裂电压和碰撞电压,试验选择的碎裂电压和碰撞电压见表1。

分析紫杉醇和三尖杉宁碱这2种特征成分的化学结构和母离子、子离子质荷比,可知其裂解规律如下:紫杉醇和三尖杉宁碱均由一个相同的C6－C8－C6环结构和一个不同的侧链基团组成。紫杉醇及三尖杉宁碱均可形成稳定的[M＋Na]＋峰,m/z分别为876.1(紫杉醇加钠峰),854.1(三尖杉宁碱加钠峰)。碰撞后,以T 代表C6－C8－C6环结构,SCH代表各自的侧链基团。紫杉醇m/z为308.0的子离子为[M－T＋Na]＋,m/z为531.0 的子离子为[M－SCH－CH3COOH＋Na]＋;三尖杉宁碱m/z为286.0的子离子为[M－T＋Na]＋,m/z为531.0的子离子为[M－SCH－CH3COOH＋Na]＋。试验选择的质谱条件见1.2节。

2.5 前处理条件的选择

2.5.1 净化方法

使用空白白酒样品配制200.0μg·L－1的紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液,考察了C18柱净化、石墨化炭黑柱净化、Qu ECh ERS法(N-丙基乙二胺和炭黑吸附剂)净化以及50倍直接稀释法进样等4种净化方法对紫杉醇和三尖杉宁碱回收率的影响,平行测定6次,结果见表3。

表3 净化方法对紫杉醇和三尖杉宁碱回收率的影响Tab.3 Effect of purification method on recovery of taxol and cephalomannine%

试验结果表明:C18柱净化时流量较慢,耗时较长;QuEChERS法净化时,紫杉醇和三尖杉宁碱的回收率偏低,重复性较差;直接稀释法进样和石墨化炭黑柱净化时,紫杉醇和三尖杉宁碱的回收率均较好。为了尽量简化试验步骤,试验选用直接稀释法进样。

2.5.2 样品稀释溶剂

试验分别考察了样品稀释溶剂依次为水、30%甲醇溶液、40%甲醇溶液、50%甲醇溶液、60%甲醇溶液、70%甲醇溶液、80%甲醇溶液和甲醇时对紫杉醇和三尖杉宁碱测定的影响。结果表明:样品稀释溶剂为70%甲醇溶液时,紫杉醇和三尖杉宁碱的响应值最高。试验选择样品稀释溶剂为70%甲醇溶液。

2.5.3 过滤方法

试验中发现:采用0.22μm 有机滤膜(材质为尼龙66)过滤时,紫杉醇和三尖杉宁碱会被滤膜吸附,紫杉醇损失较大,三尖杉宁碱也有少量损失。因此,样品溶液上机前不过滤膜,采用离心方式沉淀杂质,减少干扰的同时可以避免过滤造成的紫杉醇和三尖杉宁碱的损失。

2.6 基质效应

测定对象的基质通常会对目标成分的分析过程产生干扰,影响分析结果准确性[18-19]。在实际应用过程中,色谱-质谱法的准确度、精密度很容易受到基质干扰[20],红豆杉和白酒的成分复杂,因此需要评价所建立的测定方法中基质效应带来的影响[21]。

采用空白白酒配制基质匹配的紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液(0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L－1),同时用样品稀释溶剂配制5个相同质量浓度的紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液,以基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率之比与100%的差来考察化合物的基质效应[22-23]。结果表明:红豆杉酒中紫杉醇和三尖杉宁碱的基质抑制率分别为－9.5%和－6.8%,基质效应表现为弱抑制效应[24]。因此,本方法可以不考虑基质效应对定量的影响。

2.7 标准曲线、检出限和测定下限

移取适量的1 000 mg·L－1紫杉醇和三尖杉宁碱标准储备溶液用70%甲醇溶液逐级稀释混合成低含量和高含量两种含量梯度的混合标准溶液。低含量的紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液系列均含0,0.050,0.100,0.200,0.500,1.00μg·L－1的紫杉醇和三尖杉宁碱。高含量的紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液系列含0,20.0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L－1的紫杉醇,0,5.00,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg·L－1的三尖杉宁碱。

按仪器工作条件对低含量和高含量的紫杉醇和三尖杉宁碱混合标准溶液系列进行测定,并以紫杉醇和三尖杉宁碱的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。紫杉醇与三尖杉宁碱的线性范围、线性回归方程和相关系数见表4。

表4 线性范围、线性回归方程和相关系数Tab.4 Linearity ranges,linear regression equations and correlation coefficients

以3 倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),以10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N),得到紫杉醇与三尖杉宁碱的检出限均为2.5μg·kg－1,测定下限均为8.3μg·kg－1,远小于市场上红豆杉酒实际样品测定值,灵敏度完全可满足实际测定的需要。紫杉醇和三尖杉宁碱的实际样品测定值与方法检出限相差数百至数千倍,故低含量和高含量的两条标准曲线,可分别适用于空白样品和阳性样品的分析,可避免标准曲线含量范围跨越过多数量级,造成线性拟合失真。

2.8 精密度和回收试验

按试验方法对空白白酒样品进行加标回收试验,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表5。

表5 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表5可知:回收率为96.4%～116%,RSD 为1.1%～2.6%。本方法的准确度和精密度满足GB/T 27404－2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求。

2.9 样品分析

按试验方法对10批网络平台购买的红豆杉酒(红豆杉果酒、红豆杉树皮酒)进行分析,结果见表6。

表6 样品分析结果Tab.6 Analytical results of the samples mg·kg－1

由表6可知:10份样品均检出红豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉宁碱,红豆杉树皮酒中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量比红豆杉果酒中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量高。本方法适用于红豆杉果酒和红豆杉树皮酒的识别。

按试验方法对市场上常见的植物类保健酒样品和配制酒样品进行分析,以验证方法的特异性。试验分析了3批次枸杞酒、1批次桂圆枸杞酒、2批次参酒、1批次八珍酒、2批次露酒等9批保健酒,1批次纯谷酒、1批次苦荞酒共2批次配制酒,这些酒的原料涉及枸杞、桂圆、人参、黄芪、五加皮、肉桂、天麻、杜仲、黄精、木瓜、黑桑椹、葛根、山楂、沙棘等中药材或植物。结果表明:11批样品均未检出紫杉醇和三尖杉宁碱,说明其他植物类酒并未含有紫杉醇和三尖杉宁碱,本方法特征成分的选取和测定具有特异性。

本工作建立了测定白酒中红豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉宁碱含量的高效液相色谱-串联质谱法,方法步骤简便、快速,方法学指标符合食品理化检测质量控制规范。通过本方法分析网络平台购买的红豆杉酒样品,全部样品均检出紫杉醇和三尖杉宁碱,而对其他若干种中药材保健酒样品的分析均未检出紫杉醇和三尖杉宁碱。这表明网络平台售卖的所谓红豆杉酒存在较大食品安全风险。本方法可应用于酒中红豆杉特征成分含量的测定,为市场监管部门对酒中非法添加红豆杉违法行为的执法稽查提供了技术支持,为进一步制定食品中非法添加红豆杉补充检验方法和国家检测标准提供了技术基础。另外,可通过本方法对市场上出现的可疑红豆杉酒开展监测和分析,为市场监管部门制定食品安全风险监测计划提供依据,有利于遏制红豆杉被误用、滥用或违规使用的势头。