马尾藻多糖提取工艺的优化及抗氧化性
2020-11-06赖文婷肖玉秀
齐 丹，赖文婷，肖玉秀
(海南热带海洋学院 a.生态环境学院;b.理学院，海南 三亚 572022)
0 引言
马尾藻(Sargassum)在我国多产于东南沿海的温水海域，资源丰富，营养价值高，食用历史悠久[1].研究表明，海藻中提取的海藻多糖及其衍生物具有免疫调节、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种生物和生理活性[2-6].多糖溶于水，不溶于乙醇.水提醇沉法便是根据多糖在水和乙醇中溶解度不同的特性，将其分离提取的一种方法.与其他提取方法相比，该方法成本低、生产方便、简单安全、可用于大规模生产.本研究利用正交实验优化马尾藻多糖的提取工艺，并研究其抗氧化性，旨在为马尾藻的进一步开发提供依据.
1 材料与方法
1.1 样品预处理
采集海南省三亚市潮间带新鲜的大洲马尾藻(S.dazhouense)，洗净泥沙和表面盐离子，80 ℃干燥，粉碎过50目标准筛，保存于干燥器内待用.
1.2 多糖提取
参考于淑池等提取海南苦丁茶多糖的方法[7]，提取马尾藻多糖.称取一定量的干燥马尾藻粉加入纯水，一定温度下恒温水浴一段时间，不断搅拌，静置冷却后离心，取上清液.多次提取，合并上清液.将多次提取后的上清液使用旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩后溶液冷却至常温，活性炭脱色后缓慢加入乙醇，不断搅拌，析出多糖沉淀，再次离心，收集多糖.最后将多糖依次用无水甲醇、丙酮和乙醚洗涤，除去水分和杂质，将洗涤后的多糖溶解于100 mL去离子水中，得到多糖溶液.
1.3多糖提取率测定
采用苯酚-硫酸法[8-9]测定马尾藻多糖浓度，计算提取率.
1.4正交实验
根据单因素实验结果确定实验因素和水平，采用正交表设计实验，利用正交设计助手和SPSSAU软件对数据进行分析，优化马尾藻多糖提取工艺.
1.5马尾藻多糖体外抗氧化性测定
1.5.1 马尾藻多糖的DPPH抗氧化活性
采用DPPH法[10]测定马尾藻多糖DPPH抗氧化活性.配制DPPH无水乙醇溶液，取不同浓度的马尾藻多糖溶液与DPPH无水乙醇溶液混匀，控温避光反应30 min，517 nm处测吸光值.
1.5.2马尾藻多糖对羟基自由基的清除作用
采用Fenton法[11]测定马尾藻多糖对羟基自由基的清除作用.在9 mmol·L-1FeSO4溶液中加入不同浓度的马尾藻多糖溶液，混匀后加入H2O2溶液，静置10 min，再加入9 mmol·L-1水杨酸溶液，摇匀静置1 h后，测510 nm处吸光值.
1.5.3 马尾藻多糖的还原力测定
采用三氯乙酸法[12]测定马尾藻多糖的还原力.分别取不同浓度的马尾藻多糖溶液，加入pH6.6磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃下水浴加热20 min，冷却至室温，再分别加入三氯乙酸和FeCl3溶液，10 min后测定其在700 nm处的吸光度.
1.6数据处理
使用OriginPro 9.1进行数据处理并制图.
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 不同提取时间对马尾藻多糖提取率的影响
分别称取5份10 g预处理后的马尾藻粉，采用1∶40的固液比加入400 mL的蒸馏水中，于80 ℃条件下，分别水浴提取2，3，4，5，6 h，将冷却后的溶液在2 500 r·min-1的转速下离心30 min.提取2次，合并上清液，然后测定多糖提取率，结果见图1.
图1 不同提取时间对多糖提取率的影响
从图1可知，提取时间为2～4 h时，多糖提取率随提取时间的增加而大幅度提高，从7.78 g·kg-1迅速升高至14.71 g·kg-1；提取时间为4～6 h时，多糖的提取率变化不大，维持在14.7～14.9 g·kg-1之间；当提取时间为5 h时，多糖提取率最大，且为14.84 g·kg-1.
因此，马尾藻多糖最佳提取时间约为4 h，此时多糖几乎完全溶于水溶液中，再增加水浴时间，对马尾藻多糖的提取率无明显提高，而且增加能耗.
2.1.2不同水浴温度对马尾藻多糖提取率的影响
分别称取5份10 g经预处理后的马尾藻粉，按1∶40的固液比加入蒸馏水，分别在60，70，80，90，100 ℃下水浴提取4 h，将冷却后的溶液在2 500 r·min-1的转速下离心30 min.提取2次，合并上清液，然后测定多糖提取率.
图2 不同提取温度对多糖提取率的影响
从图2可知，提取温度为60～70 ℃时，马尾藻多糖提取率增长速度较慢，约为12.5 g·kg-1；提取温度为70～90 ℃时，马尾藻多糖提取率显著增加，从12.64 g·kg-1增加至15.65 g·kg-1；提取温度为90～100 ℃时，马尾藻多糖提取率不再升高反而轻微降低.实验结果表明，当提取温度为90 ℃时，多糖提取率最大(15.65 g·kg-1),因此，最佳提取温度为90 ℃.
2.1.3 不同固液比对马尾藻多糖提取率的影响
分别称取5份10 g经预处理后的马尾藻粉，分别按1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的固液比加入蒸馏水，在80 ℃下水浴提取4 h，将冷却后的溶液在2 500 r·min-1的转速下离心30 min.提取2次，合并上清液，然后测定多糖提取率，结果见图3.
图3 不同固液比对多糖提取率的影响
从图3可知，固液比在1∶20～1∶30时，马尾藻多糖提取率增加缓慢，由10.44 g·kg-1增加到11.08 g·kg-1；固液比在1∶30～1∶50时，马尾藻多糖提取率迅速增加，从11.08 g·kg-1增加至15.20 g·kg-1；固液比在1∶50～1∶60时，马尾藻多糖提取率基本不变，由15.20 g·kg-1增加到15.31 g·kg-1.因此，最佳的提取固液比为1∶50.
2.1.4 不同提取次数对马尾藻多糖提取率的影响
分别称取5份10 g经预处理后的马尾藻粉，按1∶40固液比加入蒸馏水，在80 ℃下水浴提取4 h，将冷却后的溶液在2 500 r·min-1的转速下离心30 min，分别提取1，2，3次，合并上清液，然后测定多糖提取率，结果见图4.
图4 不同提取次数对多糖提取率的影响
从图4可知，马尾藻多糖在提取1次时，提取率为10.61 g·kg-1，并不能完全提取马尾藻多糖；提取次数为2时，马尾藻多糖的提取率达13.45 g·kg-1；提取次数3次时，马尾藻多糖的提取率为13.54 g·kg-1，只比提取2次的结果高0.09 g·kg-1.从节约提取时间、成本和能耗角度考虑，提取次数为2次时最佳.
2.2正交试验优化马尾藻多糖提取条件
以多糖提取率为指标，以提取时间、提取温度、固液比、提取次数为因素，根据单因素最优点确定各因素的水平值(表1).选用L9(34)正交表设计实验，用正交设计助手软件对数据进行分析，研究马尾藻多糖提取工艺优化(实验设计及结果见表2)，以确定最优工艺.
表1 正交因素水平表
表2 L9(34)正交实验方案设计及结果
表2(续)
从表2可知，提取马尾藻多糖的主次影响因素为：提取温度>提取时间>固液比>次数.根据极差分析可以得出最佳提取工艺条件组合为A3B2C3D3，即提取时间5 h，温度90 ℃，固液比1∶60，提取次数3.
通过正交设计软件和SPSSAU v20.0软件对实验数据进行计算分析，采用对提取率影响较大的时间、温度、固液比进行多因素方差分析，结果见表3和表4.
表3 正交实验结果方差分析表
表4 三因素方差分析结果
从表4可知：提取时间和提取温度呈现出显著性(P<0.05)，说明主效应存在，会对提取率产生差异关系；固液比没有呈现出显著性(P>0.05) ，说明固液比并不会对提取率产生差异关系.
为了评价最佳工艺稳定性，称取马尾藻样品10 g进行重复实验.多糖提取率分别为18.59%，18.43%和18.65%，平均值为18.56%，可见A3B2C3D3提取率较为稳定.
2.3体外抗氧化性
2.3.1 DPPH法抗氧化活性
DPPH(1,1-二苯基-2-吡啶酰肼)是一种稳定的有机物自由基，能接受氢自由基或电子，成为一种稳定的抗磁分子，在517 nm处有一强吸收峰，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，被广泛应用于自由基的测定[13].
图5 马尾藻多糖对DPPH自由基清除能力
从图5可看出，马尾藻多糖具有一定的DPPH自由基清除活性，随着多糖浓度升高，清除率逐渐增强.当多糖浓度为2 g·L-1时，对DPPH自由基清除率可达22.988%.
2.3.2 羟基自由基的清除作用
Fenton反应是二价铁与过氧化氢反应生成羟基自由基进行的后续一系列反应的统称[14].Fenton反应生成羟基自由基，而多糖可以抑制反应的进行并清除已产生的羟基自由基，其清除能力可通过520 nm处的吸光度反应[15].
从图6可看出，马尾藻多糖对羟基自由基具有一定的清除能力，随着多糖浓度升高，清除率增强.当多糖浓度为0.1～1.0 g·L-1时，对羟基自由基清除率迅速增加;当多糖浓度为1.0～2.0 g·L-1时，对羟基自由基清除率增长减缓;当多糖浓度均为2 g·L-1时，羟基自由基清除率可达27.596%.
图6 马尾藻多糖对羟基自由基清除能力
2.3.3 马尾藻多糖的还原力
还原力是评价抗氧化性的指标之一.具有还原能力的物质作为电子供体，能够还原脂质过氧化过程中的中间氧化产物，因此物质的还原能力可以看作其潜在的抗氧化性能的重要体现[16].还原力测定的方法是利用样品的抗氧化能力，可以把赤血盐[K3Fe(CN)6]还原成黄血盐[K4Fe(CN)6]，再将黄血盐与含铁离子的溶液混合反应，测定生成的普鲁士蓝在700 nm波长吸光值，以此来检验其生成量的多少.而吸光值的大小是判断样品还原能力的依据，样品还原力越强，吸光值越高.
图7 马尾藻多糖的还原力
从图7可看出，马尾藻多糖虽具有一定的还原能力，且随着多糖浓度升高，还原力越强.当多糖浓度为2 g·L-1时，吸光度值可达0.497，但明显不及维生素C的还原性强.当维生素C浓度为2 g·L-1时，吸光度值可达1.324，此时马尾藻多糖的还原力约为维生素C的1/3.
3 结论
多糖作为马尾藻中重要的活性成分之一，具有广阔的应用发展前景.本研究首先采用正交实验方法，确定马尾藻多糖的最佳提取工艺条件为提取时间5 h，温度90 ℃，固液比1∶60，提取次数3.然后，通过DPPH法、Fenton法和三氯乙酸法，分别测定马尾藻多糖对DPPH自由基、羟基自由基的清除能力和还原力.实验结果表明，马尾藻多糖具有明显的抗氧化性.
