淫羊藿苷对血管紧张素Ⅱ诱导肾纤维化的保护作用研究

顾向晨 张红利 程 烨 王 怡 陈 敏

研究[1-2]结果表明，RAAS的激活和肾脏局部血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)产生的增多在肾脏纤维化的发生和发展中起到重要作用，尤其是在糖尿病肾病相关的肾脏纤维化中扮演关键角色。据报道[3-5]，雌激素可以缓解多种动物模型(包括糖尿病肾病动物模型)诱导的肾间质纤维化，但是该激素较多不良反应限制了其在临床的应用和普及。雌激素样作用药物可代偿性升高机体雌激素水平，并可安全、有效地拮抗RAAS激活诱导的肾脏纤维化[6-7]。中药仙灵脾的有效成分淫羊藿苷(icariin)可发挥雌激素样作用，具有抗肾脏纤维化的优势[8-9]。基于上述文献报道，本研究尝试探索淫羊藿苷在Ang Ⅱ诱导的肾纤维化中的保护作用，及其可能的作用机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物和材料 本研究通过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物伦理委员会审核批准(动物伦理批准号为15559)。选用36只清洁级雌性Wistar大鼠，12周龄，体重为200～300 g；均购自上海市斯莱克实验动物有限公司，合格证号为2013001807198。逆转录试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒均购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司。转化生长因子β1(transforming growth factor β1,Tgfβ1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，Ctgf)、纤维粘连蛋白(fibronectin，Fn)、Ⅰ型胶原 (collagen type Ⅰ，ColⅠ)α1、Ⅲ型胶原 (collagen type Ⅲ，ColⅢ)α1、Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ，ColⅣ)α1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、β-肌动蛋白(β-actin)基因引物序列均由上海达维科生物科技有限公司合成。

1.2 实验动物分组 将36只雌性Wistar大鼠随机分为6组，即假手术(Sham)组、假手术+血管紧张素Ⅱ(Sham+AngⅡ)组、假手术+血管紧张素Ⅱ+淫羊藿苷(Sham+AngⅡ+I)组、手术去势(OVX)组、手术去势+血管紧张素Ⅱ(OVX+AngⅡ)组、手术去势+血管紧张素Ⅱ+淫羊藿苷(OVX+AngⅡ+I)组，每组6只。

1.3 动物模型和细胞模型建立

1.3.1 大鼠OVX模型建立 以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉各组大鼠后，切开Sham组、Sham+AngⅡ组、Sham+AngⅡ+I组大鼠背部后不予任何处理，缝合手术切口。切开OVX组、OVX+AngⅡ组、OVX+AngⅡ+I组大鼠背部后，在肾脏下方脂肪内取出卵巢，用止血钳结扎双侧输卵管，切除双侧卵巢，手术完成后消毒，逐层缝合手术切口。

1.3.2 大鼠AngⅡ模型建立 以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉各组大鼠后，均于大鼠背部植入购自美国加州Alzet公司的药物泵(型号为2ML4 Osmoticminipump)，以2.5 μL/h速度持续释放药物溶液28 d。Sham组和OVX组植入的药物泵仅含有0.9%氯化钠溶液，其余4组大鼠植入的药物泵均为含有AngⅡ的0.9%氯化钠溶液并给予1 000 ng/(kg·min)的AngⅡ泵注。

1.3.3 药物干预模型建立 在建立大鼠AngⅡ模型的同时，将淫羊藿苷粉剂溶解于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，稀释成质量浓度为20 g/L的淫羊藿苷混悬液，并分别对Sham+AngⅡ+I组和OVX+AngⅡ+I组大鼠进行灌胃，100 mg/(kg·d),1次/d，持续28 d。造模完成后，以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉各组大鼠，心脏取血后处死大鼠，再以0.9%氯化钠灌注获取组织。

1.3.4 细胞培养和处理 取处于对数生长期的大鼠肾脏正常成纤维细胞株(NRK-49F，来源于美国ATCC细胞库)，以含5%小牛血清的高糖DMEM培养液混悬细胞后，将细胞种植于10 cm细胞培养皿，待细胞生长至60%～70%融合度后，以含0.5%小牛血清培养液饥饿细胞48 h以完成同步化，并分为3组，即对照组[仅添加二甲基亚砜(DMSO)溶液]、AngⅡ组、AngⅡ+I组。予DMSO处理对照组。予10-6mol/L AngⅡ 刺激AngⅡ组细胞。AngⅡ+I组在加入10-6mol/L AngⅡ前1 h，予10-6mol/L 溶于DMSO的淫羊藿苷预处理。24 h后收集各组细胞株，以备提取细胞总RNA。

1.4 检测项目与方法

1.4.1 肾功能和尿微量白蛋白/肌酐(MA/Cr)检测 应用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清尿素氮和血清肌酐值，采用免疫比浊法检测各组大鼠尿MA/Cr比值。

1.4.2 雌二醇(E2)和促卵泡素(FSH)检测 采用ELISA法测定各组实验大鼠血清E2和FSH水平。

1.4.3 肾脏组织间质纤维化程度测定 石蜡包埋各组大鼠肾脏组织，行Masson染色。在每张组织切片中，随机挑选10个200倍视野进行拍照、观察。应用Image-Pro Plus 6.0软件分析每张照片的视野，计算蓝色胶原纤维面积与所拍摄组织面积的比值，定量各样本胶原纤维面积百分比。

1.4.4 实时荧光定量PCR法检测目的基因表达 ①总RNA提取：采用美国Invitrogen 生命技术有限公司的TRIzol裂解液裂解各组肾脏组织或细胞，提取组织或细胞总mRNA。②逆转录：按照美国Applied Bioscience公司的逆转录试剂盒操作步骤，将提取的mRNA逆转录为cDNA。③实时定量PCR法：以cDNA为模板行目的基因扩增。检测各基因在各实验组样本中的表达水平，扩增后目的基因相对表达量=2-(目的基因CT-内参基因CT)。体内、体外各组纤维相关基因以倍数值表达，即各处理组与对照组的比值。

2 结 果

2.1 各组大鼠肾功能和尿MA/Cr值比较 与Sham组相比，OVX组血清肌酐、尿素氮水平和尿MA/Cr值均轻度升高，但差异均无统计学意义(P值均>0.05)。Sham+AngⅡ组和OVX+AngⅡ组血清肌酐、尿素氮和尿MA/Cr值分别较Sham组和OVX组显著升高(P值均<0.05)。 Sham+AngⅡ+I组和OVX+AngⅡ+I组血清肌酐、尿素氮水平和尿MA/Cr值分别较Sham+AngⅡ组与OVX+AngⅡ组显著降低(P值均<0.05)。上述结果证实，淫羊藿苷干预可缓解AngⅡ引起的大鼠肾功能损伤。见表1。

表1 各组模型大鼠肾功能指标和尿MA/Cr值比较

2.2 各组大鼠E2和FSH水平比较 与Sham组比较，Sham+AngⅡ组和Sham+AngⅡ+I组E2和FSH水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)；而OVX组和OVX+Ang Ⅱ 组E2水平均显著降低(P值均<0.05)。与OVX+Ang Ⅱ组比较，OVX+Ang Ⅱ+I组E2水平显著升高(P值均<0.05)。行去势手术的3组FSH水平均分别较未行去势手术的3组显著升高(P值均<0.05)。通过检测各组E2和FSH表达水平，证实去势手术可刺激各模型动物FSH水平升高、E2水平降低，而淫羊藿苷干预可逆转去势手术后E2的表达水平。见表2。

表2 各组模型大鼠E2和FSH水平比较

2.3 各组大鼠肾脏组织间质纤维化程度比较 与Sham组[(1.53±0.71)%]比较，Sham+AngⅡ 组肾间质纤维化面积[(7.56±2.31)%]显著增大(P<0.05)，Sham+AngⅡ+I组肾间质纤维化面积[(1.83±1.48)%]显著缩小(P<0.05)。与OVX组[(1.61±1.58)%]比较，OVX+Ang Ⅱ组肾间质纤维化面积[(9.30±4.61)%]亦显著增大(P<0.05)，而OVX+AngⅡ+I组肾间质纤维化面积[(1.86±1.62)%]显著缩小(P<0.05)。结果证实，淫羊藿苷可显著减轻Ang Ⅱ诱导的肾脏纤维化程度。见图1。

A Sham组 B Sham+AngⅡ组 C Sham+AngⅡ+I组 D OVX组 E OVX+AngⅡ组 F OVX+AngⅡ+I组；标尺距离为20 μm图1 各组大鼠肾脏间质纤维化程度(Masson染色，×200)

2.4 各组大鼠肾脏组织纤维化相关基因mRNA表达比较 为进一步检测纤维化相关mRNA水平有无变化，本研究检测了Tgfβ1、Ctgf、Fn、ColⅠα1、ColⅢα1、ColⅣα1 mRNA的表达水平。OVX组与Sham组纤维化基因表达水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。与Sham组比较，Sham+Ang Ⅱ组纤维化相关基因表达量均显著增加(P值均<0.05)； Sham+Ang Ⅱ+I组纤维化相关基因表达量均较Sham+Ang Ⅱ组显著下降(P值均<0.05)。与OVX组比较， OVX+Ang Ⅱ组纤维化相关基因表达量均显著增加(P值均<0.05)；与OVX+Ang Ⅱ组比较，OVX+Ang Ⅱ+I组纤维化相关基因表达量均显著下降(P值均<0.05)。结果证实，淫羊藿苷通过干预纤维化相关基因表达介导肾脏保护作用。见表3。

表3 各组模型大鼠纤维化因子mRNA表达水平

2.5 各组NRK-49F细胞株Fn和ColⅠα1 mRNA表达水平比较 为进一步明确淫羊藿苷是否直接作用于肾脏成纤维细胞，抑制该细胞表达纤维化因子，予AngⅡ刺激和淫羊藿苷干预NRK-49F细胞株。与对照组相比较，AngⅡ组Fn和ColⅠα1 mRNA水平均显著升高(P<0.01)。与AngⅡ组相比，AngⅡ+I组Fn和ColⅠα1 mRNA水平显著降低(P<0.01)。结果提示，淫羊藿苷可下调AngⅡ诱导的细胞纤维化因子表达。见表4。

表4 淫羊藿苷处理对纤维化因子mRNA表达变化影响

3 讨 论

沈自尹[10]研究认为，“肾为先天之本，是元阴元阳之所，五脏之阴非此不能滋，五脏之阳非此不能发”。在人生长、发育、壮盛和衰老的生命过程中，肾脏的功能正常与否对机体的生命质量起着举足轻重的影响。应用补肾中药，可使患者肾气得复、气化通利、水道通畅，病情趋于痊愈。现代药理学对补肾药物进行的单味中药药理研究[11]发现, 鹿茸、补骨脂、蛇床子、紫河车、锁阳、仙茅、仙灵脾、菟丝子、肉从蓉、巴戟天、杜仲都具有性激素样作用, 能促进雌性动物子宫、卵巢发育，尤以仙灵脾研究较多。据报道[12]，仙灵脾可上调小鼠子宫增重的幅度和小鼠体内雌激素水平；因其主要有效成分为具有植物雌激素样作用的淫羊藿苷。

本研究发现，淫羊藿苷在AngⅡ诱导的肾纤维化模型中具有确切的保护作用，Masson染色检测和纤维化因子mRNA水平表达检测，以及肾功能指标检测结果均提示，淫羊藿苷干预可抑制动物模型组织纤维化相关基因表达水平、缩小肾脏组织纤维化面积。本研究中，与Sham+AngⅡ组相比，OVX+AngⅡ组大鼠血清尿素氮水平和纤维化相关基因mRNA表达水平均显著升高，此结果与临床上观察到的男性较女性更易发生慢性肾脏病，且男性患者疾病进展较快的现象相一致；围绝经期女性患者慢性肾脏疾病病情进展显著快于未绝经女性患者[13-14]。已有研究[1-2,15]结果证实，雌激素水平的升高可抑制多种动物疾病模型导致的肾脏组织肾纤维化的进展；外源性雌激素替代治疗可减轻疾病模型大鼠的肾间质纤维化。本研究中，与OVX+AngⅡ组大鼠相比，予淫羊藿苷干预后，大鼠E2水平显著升高；而在未去势组中，予淫羊藿苷干预后，大鼠E2水平亦有上升趋势；证实淫羊藿苷作为一种植物来源的雌激素样物质，可能具有缓解AngⅡ诱导的肾脏纤维化作用。

雌激素作用的发挥主要依赖于其与受体α和β的相结合。本课题组曾尝试验证淫羊藿苷是否有类雌激素样作用，以及是否通过与雌激素受体结合，影响下游纤维化因子的表达;结果发现，AngⅡ刺激或淫羊藿苷干预后雌激素受体α和β在蛋白和mRNA水平的表达均无显著变化(实验数据未显示)。在上述研究中，同组样本间雌激素受体α和β的mRNA表达水平具有较大差异，致使数据缺乏统计学意义；同时，上述研究样本量较小，需设计大样本量、细化分组的动物实验进一步验证相关结论。有研究[16]结果显示，在雌激素受体α和β敲除小鼠的心脏骤停引发急性肾损伤的模型中，外源性雌激素的干预仍可显示出肾脏保护作用，提示雌激素可能通过其他途径发挥该作用。雌激素可通过与G蛋白偶联的雌激素受体1(G-protein coupled estrogen receptor 1， GPER1)结合，反式激活表皮生长因子受体，并进一步激活下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信号通路，调整下游基因表达水平[17]。研究[18]发现，在乳腺肿瘤细胞株中，17-β E2可通过GPER1，激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路，抑制转化生长因子β/果蝇去功能化蛋白(TGF-β/Smad)信号通路作用。此外，GPER1激动剂可激活GPER1，从而抑制心脏成纤维细胞的增殖[19]。GPER1在肾小管上皮细胞亦有表达，雌激素可激活GPER1，增加近曲小管巨蛋白(megalin)表达，减少氧自由基的生成[20]。亦有研究[21]结果显示，激活GPER1可以抑制系膜细胞合成细胞外基质和系膜细胞的迁移 。因此，GPER1的激活，可参与调控自噬、增殖、炎症反应等一系列信号通路，并抑制组织和细胞纤维化的发生和发展[19,22-24]。

研究[25]结果显示，淫羊藿苷可缓解硫代乙酰胺导致的肝脏纤维化。淫羊藿苷对早期糖尿病性肾病和顺铂导致的急性肾损伤动物模型，也有明确的保护作用[26-27]。另外，淫羊藿苷预处理的人脐带间充质干细胞输注至慢性肾衰竭或慢性肝损伤的大鼠体内，可显著减轻模型大鼠脏器纤维化程度[28-29]。同时，淫羊藿苷对 IgA 肾病模型大鼠纤维化的肾小球具有保护作用[30]。体外实验[31]结果证实，淫羊藿苷可以通过激活 GPER1、 下调 TGF-β信号通路表达水平、下调ERK1/2 通路磷酸化水平、抑制Smad2/3 蛋白合成，从而抑制高糖引起的肾小球系膜细胞Col Ⅳ和纤维连接蛋白的合成。研究[32]发现，淫羊藿苷可能通过GPER1 调控足细胞线粒体的稳定性。

综上所述，本研究通过动物模型和体外细胞实验证实淫羊藿苷可缓解AngⅡ诱导的肾脏纤维化，但其具体作用机制有待进一步明确。因此，本课题组将在后续研究中进一步探讨淫羊藿苷的肾脏保护作用机制，以及该物质的抗纤维化作用是否由GPER1介导产生。