循环微RNA参与静脉血栓栓塞的形成机制及其诊断价值

彭 玲 周 超

静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)是仅次于卒中和心肌梗死的第三大心、脑血管疾病，主要包括深静脉血栓栓塞(deep venous thrombosis，DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism， PE)，主要病理学表现为血液凝固并形成栓子，使血管完全或不完全堵塞。目前，普遍观点认为其主要发病机制为血管壁损伤、血流动力学改变和血液成分变化，而长期制动、手术、创伤、妊娠、产褥期、癌症等为其主要高危因素[1]。

VTE的临床表现缺乏特异性，常难以得到及时准确的诊断，因而易延误病情。此外，目前临床普遍使用的血浆生物学标志物D-二聚体的水平会随着年龄的增长而升高；因此，对所有年龄的人群均采用500 μg/L作为界限值的临床效用较低，故以D-二聚体阴性作为VTE的排除标准仍存在一定的假阴性(7%左右)[2]。而有“金标准”之称的血管造影，因造影剂对心血管、肾脏有损害作用，以及其技术要求高或临床禁忌证较多而导致应用受限。因此，寻找一项具有高灵敏度与高特异度的生物学标志物来辅助诊断VTE有较大的临床意义[3]。

微RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为21～25个核苷酸的内源性非编码RNA。最初在细胞核内合成初始RNA,继而由RNA聚合酶Ⅱ转录，核糖核酸酶Ⅲ(Drosha)切割，产生的miRNA被转运到细胞质中，由核糖核酸酶Ⅲ(Dicer)加工成双链miRNA。其中一条双链代表成熟的miRNA，并被组装成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，而另一条双链则被降解，整合到RISC中的miRNA即可通过抑制、诱导或降解信使RNA(mRNA)调控翻译而影响机体病理生理功能，在细胞分化、增殖、代谢、衰老、凋亡等生物学现象中起着至关重要的作用，从而参与机体在各种疾病中的病理过程，并促进其发展[4]。miRNA可稳定存在于血浆微粒体和外泌体中，或与蛋白质结合为复合物，以保护miRNA不被降解。在过去的几年里，血浆和血清miRNA谱被广泛地用于疾病(如心肌梗死、动脉粥样硬化、心力衰竭、肿瘤等)的诊断和预后的预测中。此外，近期研究发现miRNA可影响血小板相关蛋白、组织因子，以及血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)的表达,从而在血栓形成与止血过程中发挥重要作用[5-6]，然而，目前对miRNA在静脉血栓形成中的作用尚处于探索阶段，关于其与PE的联系也仅限于一些小样本量的研究。

1 miRNA与血栓形成

血栓形成是指在一定条件下，循环血液中的有形成分在血管内形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，使得相应部位血供障碍的病理过程。若栓塞持续存在，则可导致组织和器官坏死。一般情况下，血栓以坏死、机化或溶解再通为结局，其中血栓溶解类似于伤口愈合过程中肉芽组织的形成，是指血栓内新生血管通道形成的生物过程[7]。

1.1 miRNA与EPC EPC作为血管内皮修复过程中的一个重要因素，在机体缺血时可从骨髓中动员到外周循环，迁移并结合到内皮剥脱处或新生血管部位，促进缺血器官的修复。自Modarai等[8]首次证明了EPC对血栓具有治疗作用以来，越来越多的证据表明，内皮细胞在血管新生方面发挥着重要作用。EPC不仅可对抗持续危险因子引起的内皮细胞损伤，而且可结合并替代功能失调的内皮细胞[9]。

miRNA-126(miR-126)是血管内皮细胞中常见的miRNA，在维持内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成过程中起着重要的作用[10]。 研究[11]证实，敲除斑马鱼的miR-126可导致其胚胎发育过程中发生血管完整性丧失和出血。同样，miR-126敲除,小鼠也可发生血管完整性缺陷、出血和部分胚胎死亡[12]。近期，在一项关于miR-126对EPC功能和静脉血栓溶解影响的研究中，通过对转染miR-126模拟物的EPC进行创面愈合试验与迁移试验后发现，增加miR-126的表达可增强体外EPC的迁移能力;在管腔形成实验中，miR-126模拟物转染组与对照组也存在明显的差异(P<0.05)，表明miR-126可促进管腔形成、EPC在体内的归巢和血栓溶解;同时,敲除磷酸肌醇-3激酶调节亚基2(PIK3R2),并通过Western印迹等实验方法证实，抑制PIK3R2的表达可促进EPC的功能，表明PIK3R2是miR-126作用的靶基因[13]。在构建小鼠下腔静脉血栓模型的基础上，体外培养EPC并提取内皮衍生外泌体，用携带miR-126与不携带miR-126的外泌体分别对模型小鼠进行处理，并通过组织病理学检查比较两者对于静脉血栓的治疗效果，结果发现携带miR-126的外泌体显著促进了模型动物血栓溶解，体外实验同样证实转染miR-126的外泌体增强了EPC在体外迁移的能力[14]。

miRNA-424(miR-424)则可通过靶向作用于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)来调节内皮细胞的促血管生成功能,即miR-424的过表达可减少内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成[15]。另一项基于小鼠静脉血栓模型的研究[7]证实，miRNA-150(miR-150)通过靶向SRC激酶信号抑制剂1(SRCIN 1)来调控EPC的血管生成和增殖作用，证明miR-150能促进内皮祖细胞的迁移和血栓的溶解。此外，成熟的内皮细胞可表达止血和纤溶因子。通过流式细胞仪检测显示，94%和89%的EPC表达凝血酶受体，包括蛋白酶活化受体-1(PAR-1)和血栓调节蛋白141(CD 141)，而内皮细胞蛋白C受体(EPCR)表达率为91%；其中，PAR-1是一种蛋白酶激活的G蛋白受体，是凝血酶信号传递的主要介质，参与血小板活化、平滑肌细胞迁移和增殖，在血栓形成和溶解过程中起着至关重要的作用。实时定量聚合酶链反应(qRT-RCR)法检测尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)及其受体(u-PAR)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂1和2(PAI-1、PAI-2)的表达情况后发现，上述所有基因在EPC存在时均高水平表达；其中，PAI-1是纤溶系统的关键抑制剂，通过抑制t-PA和u-PA而抑制纤维蛋白凝块的溶解[16-17]。

综上所述，EPC在血栓形成与溶解过程中扮演着重要的角色，目前的研究已发现miRNA与EPC之间存在着密切联系。因此，进一步探索两者间关系将为临床提供更好的诊治方案。

1.2 miRNA与血小板 正常情况下，机体的止(凝)血除了依赖于完整的血管壁结构和功能外，有效的血小板质量、数量，以及正常的血浆凝血因子活性也必不可少。其中，血小板在止血过程中起关键作用，可启动和促进血栓的形成。众所周知，血小板调节失衡，以及不适当活化可导致机体凝血与抗凝血系统的失衡，从而导致一系列疾病的发生，如卒中、心肌梗死、PE等。既往研究认为，血小板仅仅是巨核细胞脱落的简单碎片;然而，最新的研究发现，血小板内部还包含了一系列小分子结构，如蛋白质、RNA，以及相应的亚细胞结构等。有研究[18]结果证实，血小板是miRNA、YRNA(一种由血小板衍生的循环非编码RNA，全长YRNA具有细胞质或核定位，参与DNA复制的启动，以及核糖体RNA质量控制)和环状RNA的主要来源;在血小板激活的状态下，血小板可释放含有大量蛋白质、炎症介质和非编码RNA的微粒体。由于血小板没有细胞核，无法对miRNA进行转录，所以普遍认为其所含物质为从巨核细胞中带出，故而通过血小板可间接了解骨髓巨核细胞的功能状态。

血小板miRNA表达谱在血小板的整个生命周期中均可稳定存在，在疾病状态时则出现差异表达。在ST段抬高型心机梗死患者中因血小板激活而出现特异性miRNA丢失，某些miRNA的表达较正常人降低70%～90%[19]。其中miRNA-186-5p和miRNA-185-5p下降较明显,而miRNA-223(miR-223)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者血小板中的表达水平较健康者增加10倍以上，在血小板中的表达从健康志愿者的3.86×10-8fmol/L增加到NSCLC患者的1.80×10-6fmol/L[20]。所以，如果血小板在激活时释放miRNA，那么该miRNA在血浆和血清中表达结果可能相反，即血浆反映血小板未激活状态释放的miRNA，而血清则反应血小板激活后释放的miRNA[18]。

近期的研究[21]发现,血小板中存在的miRNA-126-3p(miR-126-3p)可调节血小板的聚集，即在小鼠体内抑制miR-126-3p表达可抑制血小板聚集，而血小板来源的微囊泡(P-MVs)可将miR-223导入到人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)并可通过靶向胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体促进HUVEC凋亡，而IGF-1及其受体系统与胰岛素抵抗和心血管疾病的发病机制有关，故miR-223 与心血管疾病之间可能存在着密切的关系[22]。就目前的研究结果来看，血小板与miRNA的关系尚不明确，血小板来源的miRNA是否可作为抗血小板药物治疗的监测指标也有待进一步验证。

1.3 miRNA与凝血因子 组织因子即凝血因子Ⅲ，是凝血级联反应的主要引发者，主要存在于血管内皮细胞，在生理性止血过程中起着至关重要的作用。在正常情况下，机体血液中不含有组织因子，只有当存在炎症反应或发生创伤等情况时，血管外组织因子暴露，并与血液中的因子Ⅶ/Ⅶa结合形成组织因子-Ⅶa复合物。组织因子-Ⅶa可激活Ⅹ因子和Ⅸ因子，从而形成凝血酶，最终形成交联的纤维蛋白，促进血栓的形成。此外，组织因子在胎盘、大脑、心脏、肾脏和肺等血管丰富的器官中高表达，以避免这些器官在受损时发生过度出血[23]。

miRNA可稳定存在于机体的血液、唾液、尿液等体液中，取样方便，是目前生物学标志物研究中的热点。miRNA与组织因子之间的关系也值得探索。一项使用miRNA-145(miR-145)模拟物处理血栓动物模型的研究[24]发现，通过体内miR-145模拟给药恢复血栓动物模型体内miR-145水平，可导致组织因子表达水平和活性降低，使血栓形成减少。进一步研究也证实,在静脉血栓患者体内miR-145表达水平降低，且与患者组织因子水平的升高相关。由此可知，miR-145可能参与了机体组织因子的调节，静脉注射miR-145模拟物或许可抑制机体血栓的形成。

此外，研究[25]还发现存在于内皮细胞的miRNA-19a(miR-19a)可参与血管稳态和动脉粥样硬化保护机制。miR-19a的高表达与组织因子蛋白的降低、组织因子介导的促凝作用，以及以血管黏附分子-1的表达有关。而进一步对不同级别miR-19a表达情况的检测也发现，高miR-19a表达组患者血液中组织因子蛋白水平明显低于低miR-19a表达组。高miR-19a表达组患者血液中因子Ⅹa活性也明显低于miR-19a组。最终数据显示,所有患者血浆miR-19a水平与组织因子蛋白和组织因子活性呈显著负相关。

组织因子的前体为凝血活酶，是外源性凝血途径的启动者，其可因多种外源性刺激而在血管平滑肌细胞、内皮细胞和单核细胞中被显著诱导表达、提高活性。其中，TNF-α可强烈诱导内皮细胞组织因子的表达。Li等[26]在小鼠和培养的内皮细胞实验中证实，无论有无TNF-α的刺激，miR-223的过表达都可通过结合组织因子 3’-非翻译区(3’UTR)的序列来抑制组织因子的促凝活性,表明miR-223不仅能抑制组织因子的促凝活性，而且能部分阻断TNF-α诱导的内皮细胞中组织因子促凝活性的增加。故miRNA可为抑制患者血栓形成提供一种可能的治疗方法。

2 miRNA对VTE的诊断价值

目前，相关研究主要通过微阵列分析或miRNA基因芯片高通量检测进行筛选miRNA，然后再对所检测的血浆或血清中可疑的miRNA进行定量RT-RCR予进一步验证。自确认miRNA稳定存在于血浆、血清等体液以来，其已被陆续证明在包括VTE在内的多种疾病中具有潜在诊断价值。

2.1 miRNA对DVT的诊断价值 DVT多发生于下肢。血浆D-二聚体是目前唯一在临床上得到广泛应用的生物学标志物，主要反映纤维蛋白降解水平，阴性结果是排除DVT的有力证据，但阳性结果特异度低，在多种非血栓性疾病中也可升高，包括弥散性血管内凝血、感染、肿瘤等。

目前的研究已发现miRNA在DVT中有潜在诊断价值。一项关于骨科手术后DVT患者(18例患者和20名健康对照者)的研究[24]发现，DVT患者血清miRNA-582、miRNA-532和miRNA-195的水平较对照组显著升高(AUC=0.959、1.000、1.000)。进一步的研究[27]结果也证实血浆miRNA-320b水平升高与D-二聚体水平相关(AUC=0.79)，提示血浆miRNA-320b和D-二聚体联合检测可提高DVT诊断准确率。在对比12例DVT患者与12例无DVT患者血浆miRNA差异表达谱后发现，13种miRNA在两组间存在差异表达，DVT组血浆miRNA-143-3p与miRNA-424-5p表达较对照组高1.5倍，而miRNA-136-5p水平则显著低于无DVT者;经过性别、年龄、BMI和吸烟比例校正后，两组间miRNA-136-5p[OR(95%CI)=0.65(0.45～0.94)，P=0.02]和miRNA-424-5p[OR(95%CI)，1.89(1.24～2.87)，P=0.003]的差异仍存在统计学意义[28]。此外，miRNA-195也被发现在DVT患者血清中具有较高的表达水平，可通过靶向作用于γ-氨基丁酸(GABA)A型受体相关蛋白1(GABARAPL 1)调节人体EPC增殖、迁移和自噬等。可能是DVT患者潜在的生物学标志物[15]。

综上，目前多项研究结果表明，某些miRNA与DVT和机体高凝状态有关，尽管已知miRNA似乎不能很好地作为潜在的诊断标志物，但这将指导研究者对其进行更深一步探索，为进一步减少侵入性检查提供依据。

2.2 miRNA对PE的诊断价值 PE是一种危及生命的疾病。研究[24]结果表明，血流动力学稳定的PE患者3个月病死率为6%～11%，血流动力学不稳定或休克的PE患者病死率则为30%或更高。目前，临床诊断PE的方法包括生物学标志物(如D-二聚体)、静脉加压超声和放射性核素显像、肺通气灌注显像，以及作为金标准的CT肺动脉造影(CTPA)，诊断灵敏度可达90%。然而对于那些无法进行CTPA、肾衰竭或对造影剂过敏的患者，仍然需要简单可靠的生物学标志物检测。近期的研究[29]结果显示，仍有超过三分之一的PE病例在急诊科被漏诊。

一项基于32例急性肺栓塞(APE)患者、32名健康对照者和22例非APE患者(临床以呼吸困难、胸痛或咳嗽为主要表现)的研究[29]发现，APE组血浆miRNA-134(miR-134)水平高于正常对照组和非APE组，即血浆miR-134是APE的特异性诊断指标，区分APE组与健康对照组或非APE组的AUC分别为0.833和0.756。 Zhou等[30]对37例PE患者和正常对照者进行了miRNA检测后发现，PE患者血浆中的miRNA-28-3p(miR-28-3p)升高至健康对照者的393倍，进一步行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析表明，miR-28-3p可能参与PE相关通路，如磷酸肌醇代谢和磷脂酰肌醇信号系统。因此，血浆miR-134、miR-28-3p或可作为一种无创、稳定的PE检测生物学标志物。Liu 等[31]在比较60例APE患者与50例健康对照者血浆miRNA后发现，APE患者的miRNA-221(miR-221)表达明显增高(AUC=0.823,95%CI为0.757～0.906)，与D-二聚体联合检测时AUC=0.768，95%CI为0.727～0.853,提示miR-221可能是APE的生物学标志物。

此外，一项基于对30例经CT血管造影诊断为APE的患者与12例健康对照者的研究[32]证实，miRNA-1233(miR-1233)分别鉴别APE与非ST段抬高型心机梗死患者和健康人的灵敏度均为90%，特异度分别为100%和92%，AUC分别为0.95和0.91，该研究也证实APE患者血清中miR-134和miRNA-27a(miR-27a)表达水平升高,与健康对照者的AUC分别为0.84和0.79。然而，与健康对照者相比，无论是miR-1233与miR-134(AUC=0.88)或者miR-27a与miR-1233(AUC=0.89)两两组合,还是miR-1233、miR-134和miR-27a(AUC=0.90)三者联合检测,其诊断价值均低于单独检测miR-1233(AUC=0.91)。由此可知，miR-1233是一种很有前景的APE诊断生物学标志物。而通过对78例经CTPA确诊的APE患者和70例年龄和性别匹配的正常志愿者研究比较的结果提示，将miR-27a或miR-27b与D-二聚体联合应用可能是诊断APE强有力的生物学标志物[33]。

3 结语与展望

近年来，研究发现miRNA在细胞的发育、增殖、分化和凋亡等过程中起着至关重要的作用。由于其在机体中的高度稳定性，使得循环miRNA在包括药物性肝损伤、肿瘤、心力衰竭、2型糖尿病、稳定型心绞痛和ACS等疾病中作为生物学标志物得以广泛研究。理想的生物学标志物检测时应可重复性高，并且对某一特定疾病具有较高的灵敏度和特异度。miRNA在血浆或血清中稳定性较高，结构简单，无需后期处理修饰，有望成为理想的生物学标志物。目前，关于miRNA与VTE的研究仍面临着诸多挑战。首先，循环miRNA的检测数据十分有限，研究的样本量均较小，需要对包含更大的样本量,以及不同病程的VTE患者行进一步分析以探索其有效性和普遍性；其次，样本选择偏倚，不同样本或存在不同的表达水平；再者，循环miRNA的分析与检测方法缺乏标准化，不同检测方法或有不同实验结果；最后，各种miRNA参与机体的调节机制仍不明确，需要更深入的研究来探索其致病机制，以期更好地为VTE的诊断和预后提供新方法。