CHO 细胞大规模培养表达单克隆抗体的工艺研究

张海燕 牛辉 毕利利

华兰基因工程有限公司 河南新乡 453000

1 概述

1.1 单克隆抗体介绍

从1975 年 至 今， 单 克 隆 抗 体（monoclon alanti body，mAb）经历了从简单的杂交瘤细胞株中表达到使用成熟的动物细胞进行大规模生产的历程。目前，单克隆抗体可以分为三类，分别是鼠源性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体，其中全人源单克隆抗体也可算作人源化单克隆抗体的一个分类。

1.2 中国仓鼠卵巢细胞

CHO 细胞是指中国仓鼠卵巢细胞，是从中国灰仓鼠卵巢组织经过分离，然后进行连续传代而得到的哺乳动物细胞。目前CHO细胞是应用最为广泛的抗体生产动物细胞，据统计目前有超过70%的动物细胞表达产品由CHO 细胞表达和生产，在我国现有的绝大多数生物大分子药物都是由CHO 细胞表达[1]。

2 大规模培养工艺及可能存在的问题

规模放大策略。细胞培养工艺过程中的参数可以分为两类：与体积相关的参数和与体积无关的参数。随着反应器规模大小变化而变化的参数，在放大过程中会根据反应器通气孔径的大小和方式，以及搅拌桨的大小和形式而发生变化。一般来说，随着反应器体积的变大，通气速率一般呈线性上升的趋势。通气流速的放大一般采用单位体积单位时间的通气量（vvm）恒定的方法。其中，O2和CO2流速的放大方法在实际的操作过程中还要根据反应器中DO 和pH 控制器的类型以及工艺要求的控制策略做适当的调整。在参数放大过程中，反应器搅拌转速的放大需要考虑的因素比较多。大型反应器的搅拌速度需要考虑既能够为反应器提供足够的混合能力，还要避免造成由于高转速条件下剪切力所引起的不必要的细胞损伤。转速对体积氧传递系数（KLa）的影响，也是在放大过程中需要考虑的一个重要因素[2]。

3 CHO 细胞培养方法

随着重组蛋白等生物大分子药物的开发和发展，CHO 细胞的培养工艺研究也不断地深入。根据培养的方式CHO 细胞培养生产工艺可以分为批次培养（Batch）、补料批次培养（Fed-Batch）、连续培养。连续培养又包括浓缩补料培养（ConcentratedFedbatch）和灌流（注）培养（Perfusion）等。在细胞培养工艺开发中，需要根据各个项目的不同特点，如宿主细胞的性质、宿主细胞在培养环境中能够维持的培养周、细胞表达产品的稳定性等方面综合评估后选择合适的培养方式。

3.1 批培养方式的应用

批培养方式相比其他培养方式，因为在培养过程中不需要进行补加营养物的操作，所以在生产过程中需要的操作少，减少了培养过程中微生物污染的风险。另一方面由于不进行补料操作，培养环境中的营养物的含量在培养开始时已经确定，随着细胞的生长营养物不断减少，代谢产物持续升高，所以生产周期相对较短，对于宿主细胞本身不能维持长期生长、细胞表达产品在培养液中容易产生降解、聚集等质量变化的项目更为适合。

3.2 补料批培养方式的应用

由于批培养过程中随着细胞生长，培养液中的营养物持续下降，代谢产物持续增加，限制了细胞培养的周期，进一步限制了目的蛋白的表达量。随着细胞生长而逐渐降低的营养物，为细胞的生长提供所需营养。所以相比于不补料的批培养方式，补料批培养一般能得到更高的细胞密度，更长的细胞培养周期，更高的蛋白表达量。补料批培养方式也是目前应用最多，技术发展最完善的培养方式。虽然补料批培养方式能向培养体系中补充已经消耗的营养物，为细胞生长持续提供营养，但随着细胞密度的增加，细胞消耗越来越多的营养同时代谢出越来越多的代谢废物，而这些代谢废物无法从培养环境中被分离，最终仍然会导致细胞活率的下降，细胞培养周期一般也较为固定，目前多数的补料批培养工艺的周期约12-18 天。

3.3 连续培养

由于补料批培养方式只能向培养体系中补充营养物，无法将细胞代谢产生的副产物从培养环境中去除，所以细胞在培养到一定时间后仍然会出现细胞活率下降的现象。所以在细胞培养工艺的不断几步中，发展出了浓缩补料培养和灌注培养两种培养模式，这两种新的培养模式都能很好的解决了培养环境中细胞代谢废物对细胞的副作用。

浓缩补料培养法由于不能将目的蛋白从培养液中分离，所以在培养过程中，目的蛋白的浓度在不断升高，对于那些在培养液中不稳定的目的蛋白并不适用。而灌注培养法在培养的过程中不断地将目的蛋白从培养液中分离，而只把细胞截留在培养液中，所以目的蛋白在从细胞内被表达到胞外后，即可在较短的时间内进入到纯化环节，可以将目的蛋白与宿主细胞自身表达的酶分离。

4 培养基

本研究采用的培养基均为目前应用广泛的商业化培养基，配方如表1。

表1 培养基配方

5 结语

随着医药行业的不断发展，生物医学越来越受到人们的关注，作为生物医学的重要组成部分，单克隆抗体在CHO 细胞中的大规模培养和表达技术越来越多。通过对其CHO 细胞培养的培养基优化、培养参数分析及工艺的放大等研究分析来实现CHO 细胞大规模培养表达单克隆抗体生产工艺的稳定性，进而推动单克隆抗体产业在医药领域的不断向前发展。