甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪组织中AdPLA基因及IGF-1的表达研究

近年来，流行病学显示[1]，我国甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)的发病率呈逐步增高趋势。患者多表现为眼球突出、眼睑肿胀退缩、上睑迟滞、结膜充血水肿、限制性眼外肌病变等症状，严重者可致患者失明[2]。根据患者的病理表现其主要是因眼眶内脂肪组织增多和眼外肌肥厚纤维化以及炎性病变而发病[3]，其中眶内脂肪组织增多是诱导TAO发病的重要原因。研究发现，胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor-1,IGF-1)是主要的炎性因子，其表达水平在诊断TAO病患者中发挥重要作用[4]，但TAO患者外周血中以及眼眶脂肪组织中IGF-1含量是否增加现无明确定论。同时研究显示[5]，TAO患者眼眶脂肪细胞内脂肪生成加速，但很少有对眼眶脂肪水解方面研究的关注，而脂肪特异性磷脂酶(adipose-specife phospholipase A,AdPLA)是最重要的脂肪水解调控因子。故本研究探讨了TAO患者眼眶脂肪组织中AdPLA及IGF-1的表达，以分析AdPLA及IGF-1在TAO发病机制中的作用。

资料与方法

一、一般资料

选取我院2016 年8月至2018 年3月收治的50例TAO患者纳入研究。入选标准：①影像学检查显示双眼多条眼外肌表现为肌腹肥厚[6]；②眼眶CT显示单侧或双侧眼球突出，眼眶脂肪增多，眼外肌无肥大或肌腹轻度肥大；③甲状腺功能障碍或者有甲亢病史；④临床活动性评分(CAS)<4分；⑤首次发病，病程≤6个月。排除标准：①合并其他眼眶疾病者；②凝血功能障碍者；③伴恶性肿瘤、内分泌系统、代谢系统疾病或严重脏器功能障碍；④拒绝参与本研究。其中男性20例，女性30例，患者年龄19～69岁，平均(52.26±4.83)岁，病程(0.25±0.06)年。并取同期50例眼部整形手术者纳入对照组，男性18例，女性32例，年龄18～69岁，平均(51.87±5.62)岁。所有入组对象均对研究知情，并且签署知情同意书。

二、方法

1.主要仪器与试剂：Western Blot电泳仪(Midi-96型)，美国Thmorgan公司，离心机(Eppendorf5702型)，德国Eppendorf公司，RT-PCR仪(C1000 Touch型)，美国Bio-Rad公司，IFP全自动酶标仪(TR2100C)，德国IFP公司。RNA抽提试剂盒(RNAiso Plus，TAKARA，Cat．No．9108)，Perfect Real Time试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix，TAKARA，Cat．No．RR036A)；兔抗人IGF-1多克隆抗体(英国Abcam公司)；免疫组织化学检测试剂盒(上海基因科技有限公司)；IGF-1 ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。

2.IGF-1蛋白的检测：收集两组患者眼眶脂肪组织标本中，每个标本分成两部分，一部分经10%甲醛固定24 h，石蜡包埋，厚5 μm连续切片，行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。另一部分标本制备切片行常规免疫组织化学检测，常规脱蜡、水化组织切片，pH 6.0的枸橼酸钠修复液95 ℃水浴修复40 min，阻断过氧化物酶后PBS冲洗3次，避光孵育15 min，分别于滴加一抗，PBS再冲洗3次，37 ℃孵育45 min，二抗系统处理经DAB显色，苏木素复染，脱水并封片。400倍光学显微镜下观察组织中IGF-1蛋白的表达，以细胞核、细胞膜和细胞质内出现棕褐色染色为阳性反应，计数5个视野中细胞着色程度及着色细胞比例。参考文献确定阳性反应，并记录2个组中强阳性例数。

三、AdPLA mRNA表达

(1)RNA提取：用RNA抽提试剂盒进行RNA提取，操作按照说明书进行；(2)反转录：将1 μg抽提的RNA用Perfect Real Time试剂盒反转录成cDNA。将提取的RNA用DEPC水吹起(共8 μl)，加入2 μl 5×PrimeScript逆转录反应混合物，置于37 ℃水浴15 min，85 ℃水浴5 s，然后快速冰浴。(3)PCR：以cDNA为模板进行PCR反应来定量检测AdPLA mRNA的表达水平。通过细胞内参照基因(GAPDH)取得常态目标值，以确定mRNA的表达水平。AdPLA及GAPDH引物见表1。

表1 AdPLA及GAPDH引物序列

四、统计学方法

结 果

一、两组患者眼球突出度及眼眶脂肪量比较

TAO组患者眼球突出度、眼眶脂肪量均明显多于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 两组患者眼球突出度及眼眶脂肪量比较

二、两组患者眼眶脂肪组织中IGF-1表达

TAO组IGF-l主要在脂肪细胞的细胞膜及细胞质中呈现棕褐色表达；对照组呈淡棕色染色。TAO组眼眶脂肪细胞中IGF-1的强阳性表达率明显高于对照组(P<0.05)。见表3，图1。

表3 两组患者眼眶脂肪组织中IGF-1表达

三、两组患者眼眶脂肪组织中AdPLa基因的表达

TAO患者眼眶脂肪组织中AdPLA mRNA表达量明显高于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 两组患者眼眶脂肪组织中AdPLA基因的表达

讨 论

一、TAO的组织病理学特点

TAO属于自身免疫性的眼病，表现为眼眶炎性改变，诱发患者双眼或单眼突出，其主要病理过程为眼眶脂肪增生、炎性反应以及糖胺聚糖(GAG)沉积[7，8]。研究显示[9]，眼眶成纤维细胞在多因素刺激下被自身反应性T淋巴细胞和B淋巴细胞识别，引起自身免疫反应。导致大量炎性因子在眼眶组织中聚集，促使眼眶成纤维细胞增生并分泌大量GAG并结合大量水分，从而诱发眼眶脂肪组织和眼外肌间质水肿[10]；同时眼眶成纤维细胞增生分化为脂肪细胞，进而形成TAO的特异性表现[11]。本研究结果显示，TAO组患者眼球突出度、眼眶脂肪量均明显多于对照组(P<0.01)。与上述报道结果相似。

二、IGF-1在TAO形成中的作用

IGF-1是多种疾病的炎性标志因子，呈现高表达。本研究结果显示，TAO组眼眶脂肪细胞中IGF-1的强阳性表达率明显高于标本对照组(P<0.05)。这与王钰娇等[12]研究结果一致。可能的原因为：IGF-1可特异性地与IGF-1R结合并活化P13K信号通路，上调过氧化物酶体增生物激活受体y(PPAR7)，促进T淋巴细胞趋化因子白细胞介素-16和受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)的表达，引发全身免疫反应[13-15]，大量炎性因子知道为什么，量增生，释放大量炎性介质，眼眶成纤维细胞被激活，促进脂肪生成及分泌大量GAG[5]，从而诱发TAO。同时本研究结果显示，TAO组患者脂肪细胞的细胞膜及细胞质中可见IGF-1棕褐色染色，而对照组呈现淡棕色染色，表明IGF-1在TAO患者眼眶脂肪组织呈现高表达，可能参与了脂肪细胞增生及成熟的整个过程。

三、AsPLA在TAO形成中的作用

眼眶脂肪组织增生是TAO患者的最主要病理过程，主要表现为脂肪细胞数量的增多和脂肪细胞体积的增大。大量研究显示，TAO患者眼眶脂肪细胞的生成加快，如通过抑郁脂肪生成来改善疾病只能抑制新的脂肪细胞的增加，对于已经生成的眼眶脂肪组织则无作用，易导致已生成的组织过多堆积。而笔者经过多年的临床经验发现，除了抑制新生的脂肪组织外，加速眼眶脂肪水解则可有效解决已存在的脂肪组织的堆积，使脂肪细胞内的甘油三酯水解成游离脂肪酸(FFA)和甘油，释放循环中，从而更有利于改善眼球突出。脂肪水解的过程受很多内分泌因子和激素的调控[16]，AdPLA是其中最重要的自分泌和旁分泌的脂肪水解调控因子，它水解磷脂的sn-2位产生花生四烯酸(AA)和FFA，AA通过环氧合酶(cox)产生前列腺素E2(PGE2)，后者与脂肪细胞表面的Gai偶联的前列腺素受体3(EP3)相结合，抑制腺苷酸环化酶而抑制脂肪水解。研究表明[17]，AdPLA-缺陷小鼠出现了无限制性的全身脂肪水解。

本研究证实，TAO患者眼眶脂肪组织中AdPLA mRNA的表达量明显高于对照组。我们推测，AdPLA的高表达使得TAO眼眶脂肪水解减少，从而加重了眼眶脂肪的堆积和眼球突出。所以，利用脂肪水解原理，采用RNA干扰技术沉默眼眶脂肪AdPLA基因来促进眼眶脂肪水解，可能为TAO患者提供一条非手术的治疗方法。 综上所述，TAO患者眼眶脂肪组织中AdPLA基因及IGF-1表达均增加，二者可作为早期诊断TAO的指标，但具体是什么原因导致AdPLA基因及IGF-1表达升高，尚需进一步研究。