重组鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在多联疫苗中的免疫效果评价

荣雪路，丁国伟，魏荣荣，李琛，李甜甜

(扬州优邦生物药品有限公司，江苏 扬州 225000)

鸡新城疫(newcastle disease，ND)、禽流感(avian influenza)、传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是严重危害家禽养殖业的传染病，主要预防措施是疫苗免疫[1]。为了有效控制疾病的发生，减少免疫应激和免疫次数，多联苗成了养殖业需求的新产品之一。随着新流(ND+H9)二联苗的成功研制和应用，更多不同种抗原联合疫苗成为众多实验室研究对象[2]。目前，新城疫-禽流感-法氏囊三联疫苗(简称“新流法三联苗”)成为我国养殖业需求的疫苗新产品之一。

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease Virus，IBDV)感染引发的鸡高度接触性免疫抑制类疾病[3]。IBDV属于双股双节段RNA病毒科，无囊膜，其毒株包括经典毒株(classic IBDV，cIBDV)、变异毒株(variant IBDV，vIBDV)、超强毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)[4]。IBD主要危害3～6周龄雏鸡，是一种急性、致死性、高度接触性传染病，传播途径为消化道和呼吸道，病鸡精神萎靡、蹲伏、排黄白色黏稠和水样稀粪，极度虚弱，最后死亡，剖检可见法氏囊肿大、出血、萎缩或呈胶冻样，严重的可出现紫葡萄样，腿肌、胸肌出血等。传染性法氏囊抗原制备的原始方法是由鸡胚成纤维细胞制备，其病毒含量很低[5]，安全性较差，且疫苗成本较高。随着疫苗研制方法的不断提升和基因工程苗的出现，重组病毒蛋白成为疫苗中理想的可替代抗原，其制备简单、安全稳定、成本较低。本文在新流法三联疫苗中法氏囊部分用重组鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白作为抗原，并对免疫后鸡群的抗体水平及效力检验进行研究，为该疫苗提供免疫效果评价。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株购自中国兽医药品监察所，新流法三联苗由扬州优邦生物药品有限公司提供。SPF鸡种蛋购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，在本实验室孵化饲养到所需日龄。

1.2 方法

1.2.1 新流法三联苗免疫后ND/H9/IBDV抗体水平检测及IBDV部分效力检验

50羽21日龄SPF鸡均分为5组，进行颈部皮下免疫，1组为对照组，2组免疫剂量0.05 mL，3组免疫剂量0.1 mL，4组免疫剂量0.2 mL，5组免疫剂量0.3 mL。免疫后第21天采血，参考文献[6]，分别检测ND/H9 HI抗体及IBD AGP抗体，并进行鸡IBDV强毒BC6/85株F1代攻毒，每只点眼0.1 mL(病毒含量100 BID)，观察96 h后全部剖检，检查法氏囊病变情况。试验鸡在SPF鸡隔离器中饲养，自由采食饮水。

1.2.2 鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株BID测定

25羽30日龄SPF鸡均分为5组，进行攻毒，每只点眼0.1 mL。处理分别为：1组为对照组，2组病毒稀释度为10-2，3组病毒稀释度为10-3，4组病毒稀释度为10-4，5组病毒稀释度为10-5。试验鸡在SPF鸡隔离器中饲养，自由采食饮水。试验持续96 h。

1.2.3 AGP法检测血清中IBDV抗体水平

将30 μL抗原放入制备好的梅花型双向扩散琼脂板的中心孔，血清以2的稀释倍数稀释至5，按稀释倍数0～5依次放入梅花型外围孔，每孔各30 μL，做好标记，放入湿盒内24～48 h之间，在强光下观察并记录中间孔(抗原)和周边孔(抗体)之间出现免疫复合沉淀线的数值(数值为2稀释倍数)。

1.2.4 统计分析

数据以平均值±标准差表示，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 新流法三联苗免疫后ND/H9部分抗体检测

由表1可知，新流法三联疫苗免疫后21 d，0.3 mL免疫剂量组ND抗体水平为8.1log 2，H9抗体水平为9.0log 2，说明重组鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白作为抗原在疫苗中不影响ND和H9部分的免疫效果。

表1 新流法三联疫苗免疫ND及H9抗体水平

2.2 新流法三联苗免疫后IBDV部分抗体检测

由表2可知，试验组和对照组相比差异显著(P<0.05)，5组和2组差异显著。

表2 法氏囊疫苗免疫后抗体水平

2.3 鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株BID测定

将鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株从10-1稀释至10-5，对42日龄SPF鸡进行攻毒，每个稀释度重复5只，观察96 h，剖检记录各稀释度出现病变动物的百分比(表3、图1)，测得BID为102.0·(0.1 mL)-1。

表3 鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株测定结果

A—正常的法氏囊；B—紫葡萄样法氏囊；C—胶冻样法氏囊；D—胶冻样法氏囊剖开内有出血点。图1 法氏囊病变的观察结果

将鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株BID测定的试验动物中，取发病的法氏囊制备研磨液获取鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株F1代病毒，测得BID为104.0·(0.1 mL)-1(表4)。

表4 鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株F1代测定结果

2.4 效力检验(免疫攻毒保护)

攻毒对照全部发病，法氏囊外观发黄，呈胶冻样外观。囊内剖开有黏液，部分肉眼可见出血。未攻毒对照和免疫组，外观正常，剖开未见病变，免疫攻毒保护率为100%(图2)。

A—未攻毒对照组；B—攻毒未免疫组；C—免疫0.05 mL组；D—免疫0.1 mL组；E—免疫0.2 mL组；F—免疫0.3 mL组。图2 各组法氏囊的变化

3 讨论

在家禽养殖业中防治各大传染病的有效方法之一就是进行免疫。但是随着病毒病毒株的不断变异，传统疫苗对于疾病的防控效果变得越来越差。比如IBDV在未出现变异株之前，传统疫苗的经典株可以使IBD得到有效控制，但是变异株的出现，特别是超强毒株的出现，疫苗经典株的免疫失败屡见不鲜[7]。因此，了解IBDV分子变化，制备基因重组蛋白抗原，对该病的防控具有重要意义。IBDV的主要结构和功能蛋白VP2约占病毒总蛋白的51%[8]。IBDV的毒力分子基础和致病性分子标志主要在VP2上已经被国内外学者广泛研究并证实[9]，因此，VP2蛋白成为近年来IBDV新型亚单位疫苗研究的热点。

鸡新城疫(newcastle disease，ND)、禽流感(avian influenza)二联苗的成功研制和推广，从实践角度真正做到了减少免疫应激和次数，满足了市场需求，实现了一针多防的防疫效果，同时为多联苗的研制奠定了基础。

兽药管理条例及新兽药申报规程中，用于防疫这3种传染病的疫苗免疫后校验标准为新城疫免疫后3～4周，对照组鸡血清HI抗体水不高于1∶4，免疫鸡血清HI抗体水平不低于1∶16；禽流感免疫后3～4周，对照组鸡血清HI抗体水不高于1∶4，免疫鸡血清HI抗体水平不低于1∶128；法氏囊免疫后3～4周，对照组鸡血清琼扩效价均应为阴性，免疫鸡血清琼扩效价不低于1∶8。从免疫后各部分抗体水平分析，该疫苗3种抗原免疫效果均达到规定要求，免疫效果良好。3种抗原混合使用并不相互影响免疫效果。由于攻毒毒株鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株放置时间较长，为了保证其毒力，进行复壮传代一次，最终确认攻毒病毒BID为104.0·(0.1 mL)-1。攻毒后，剖检攻毒对照组均发病，法氏囊外观呈黄色胶冻样，剪开囊内有黏液，且有不同程度出血。各免疫组和未攻毒对照组相同，外观正常，囊内无肉眼可见病变，说明免疫组免疫后产生抗体可以保护病毒感染，该疫苗免疫后法氏囊病毒攻毒保护率为100%，符合兽药典要求。因此，鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白应用于多联疫苗中免疫剂量达到0.05 mL时，具有良好的免疫保护效力，且不影响疫苗中其他抗原的免疫效果。综上所述，重组鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白应用于多联疫苗中免疫效果良好。