脂肪组织来源细胞再生技术在整形修复领域中的研究进展

黄蓉，范金财

(中国医学科学院 北京协和医学院整形外科医院整形九科，北京 100144)

脂肪移植在临床的应用达100多年，1893年有学者在第23届德国外科年会上报道了第一例成功的脂肪移植，将小块脂肪组织移植用于面部软组织缺损的矫正[1]。20世纪80年代，Illouz[2]引入吸脂技术抽取脂肪，使脂肪移植得到了进一步的发展。而后，Coleman[3]对脂肪移植技术进行了改进。传统的脂肪移植分为两类，即大脂肪细胞团移植和细小脂肪细胞团移植，两者的脂肪颗粒大小虽然有区别，但均含有成活的脂肪细胞[4-5]。2001年，Zuk等[6]首次在脂肪组织中分离出间充质干细胞，与骨髓中分离出的干细胞相似，称为脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，ADSCs成为再生医学中的研究热点。随后，Matsumoto等[7]发现，从脂肪组织中分离出的基质血管成分(stromal vascular fraction，SVF)可提高脂肪移植物的存活率，继而开发了细胞辅助脂肪移植技术，标志着自体脂肪细胞移植的开端。2013年，Tonnard等[8]提出了纳米脂肪移植的概念，发现细针头注射纳米脂肪不仅可治疗面部浅表皱纹等问题，还具有巨大的再生潜能。近年来，脂肪组织来源细胞再生技术在整形修复领域得到了广泛应用。现就脂肪组织来源细胞再生技术在整形修复领域中的研究进展予以综述。

1 脂肪组织来源细胞的分类

1.1纳米脂肪及其衍生物 纳米脂肪大小为400～600 μm，甚至更小。2013年，Tonnard等[8]首次报道了纳米脂肪，制备方法为：先用侧孔直径为1 mm的吸脂针抽吸脂肪，再用0.9%氯化钠溶液冲洗，然后进行机械乳化，即在2个10 mL注射器间将抽取到的颗粒脂肪反复来回推注30次，最后用0.5 mm孔径的尼龙纱布过滤。此后，诸多学者在Tonnard法的基础上，对纳米脂肪制备过程进行调整，从而得到不同的细胞产品。Lo Furno等[9]省略制备纳米脂肪的最后一个步骤——过滤，其他制备流程不变，设计制备了二代纳米脂肪，比较两种纳米脂肪中ADSCs的细胞活性、密度以及增殖率的差异，结果发现，二代纳米脂肪中ADSCs的水平更高。同样，为了提高ADSCs水平，Pallua等[10]在Tonnard法基础上分别在机械乳化的前后各增加1次离心，并将最终产物命名为脂肪浓缩物，结果发现，脂肪浓缩物中的确含有高浓度的ADSCs和内皮祖细胞。Gu等[11]在制得纳米脂肪后，再将其以3 000 r/min速度离心3 min，以去除油层和水分，进而得到浓缩纳米脂肪。脂肪移植后存活率较低是困扰整形外科医师的难题，为提高移植后脂肪存活率，Bi等[12]首先通过Ⅰ型胶原酶化学消化，再进行离心，从而避免了机械乳化对纳米脂肪内脂肪细胞活性的破坏，最终获取脂肪产物——纳米活性脂肪，经过对比发现，纳米活性脂肪的吸收率低于纳米脂肪。Zheng等[13]提出了脂肪提取物的概念，将纳米脂肪以1 200 r/min离心5 min，发现脂肪提取物既可促进新生血管形成，也可通过减少细胞内活性氧类的堆积实现脂肪提取物对脂肪细胞的抗凋亡作用，从而提高脂肪移植存活率。结合脂肪提取物和纳米活性脂肪在提高脂肪存活率中的积极作用，脂肪提取物或纳米活性脂肪联合脂肪细胞移植可能成为一种具有临床应用潜力的新技术。

以上改良版纳米脂肪的初衷大多是提高纳米脂肪中ADSCs或SVF水平，实验室研究或临床应用也证实了制备方式的改变对纳米脂肪特性及临床效果的积极影响，但目前随机对照试验较少，证据等级较低，很难明确它们的实际疗效。此外，Stuzin[14]认为，“纳米脂肪”这一专业术语的准确性值得怀疑，Tonnard方法制备的纳米脂肪并未达到纳米级，将其称为超微米脂肪更为准确。

1.2SVF SVF是从皮下脂肪提取的去除白色脂肪细胞的细胞群，包括内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞以及大量间充质干细胞等，但不含脂肪细胞[15]。目前制备SVF常用的方法包括酶消化法和机械乳化法。酶消化法是指用含有胶原酶的缓冲液在37 ℃环境下消化脂肪，消化时间因研究人员的习惯而各有不同，胶原酶可破坏细胞外基质的胶原纤维，一旦开始分离出不同的细胞成分，即对酶消化后的产物进行离心分离，最后获取的提取液可分为三层，其中最下层的沉淀即为SVF[16]。机械乳化法是指Tonnard制备纳米脂肪所采用的方法，SVF与纳米脂肪的成分基本一致，稍有不同的是纳米脂肪内包含破碎的脂肪细胞碎片；不含酶的机械分离法在干细胞分离中的效率大大降低，且不同设备制得的SVF中干细胞和残留酶存在巨大差异[17]。尽管临床经验证明了注射胶原酶的安全性，但谨慎起见，仍应在回注前从细胞制剂中去除所有可测量的活性酶。由于SVF无需体外扩增而含有干细胞，被视为细胞再生的理想材料[18]。

1.3ADSCs ADSCs是间充质干细胞的一种。ADSCs 可分化为多个胚胎谱系，其中最重要的是中胚层谱系[19]。ADSCs不仅可分化为多种类型细胞，还具有重要的旁分泌特性，通过信号通路的调节减少瘢痕组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白的表达[20]。ADSCs的旁分泌作用还可减少紫外线诱导的细胞凋亡，缩短人真皮成纤维细胞的亚G1期[21]。目前尚未鉴定出ADSCs的单一标记，国际再生治疗学会认为，CD73、CD90和CD105是表征间充质干细胞的最低标准[22]。目前国内外尚缺乏生产ADSCs的标准流程和质量管理规范，导致ASDCs的应用面临极大制约。目前推荐的制备ADSCs的方法是用酶消化脂肪抽吸物，然后离心得到SVF，接种SVF至培养瓶中，设定培养条件为5%CO2、37 ℃，进行常规培养，保持湿度；细胞融合度达到70%～80%时可以传代，收集消化的细胞悬液，接种至培养瓶中，随后进行传代培养[23]。

与制备而来的纯粹的ADSCs相比，SVF的特点是不仅包含ADSCs，还包含内皮祖细胞、造血祖细胞和白细胞等其他细胞类型[24-25]，但不含脂肪细胞。而纳米脂肪的特点为不仅包含与细小脂肪细胞团数量相当的ADSCs，还包括破碎的脂肪细胞以及其他脂肪组织的基质成分[12]。由此看来，SVF和纳米脂肪成分基本一致，稍有不同的是纳米脂肪内虽无活的脂肪细胞，但包含破碎的脂肪细胞碎片。

2 临床应用和实验室研究

2.1减轻瘢痕 导致瘢痕的常见原因有外伤、手术等，一直以来瘢痕治疗受各种因素的限制，治疗效果欠佳。实验研究发现，生长因子可通过调节成纤维细胞增殖抑制胶原合成，实现抗纤维化，而重要的调节因子包括细胞外基质中的基质金属蛋白酶以及金属蛋白酶组织抑制剂[26]。ADSCs可合成和分泌细胞因子，为脂肪组织来源细胞再生技术应用于瘢痕治疗提供了理论基础。Tenna等[27]选择30例面部萎缩性痤疮瘢痕患者作为研究对象，给予皮下注射纳米脂肪联合富血小板血浆，结果显示，无论是否联合应用CO2激光，纳米脂肪联合富血小板血浆皮下注射均具有积极的临床疗效。Uyulmaz等[28]应用纳米脂肪治疗40例外伤导致的瘢痕患者，具体瘢痕类型不详，治疗后患者满意度达92%。然而，目前纳米脂肪中减轻瘢痕的成分尚不明确，需进一步研究将潜在的ADSCs介导的作用与其他因素分开。另外，在一组前瞻性病例研究中，Gu等[11]应用浓缩纳米脂肪联合结构脂肪治疗20例患者(共计25例面部萎缩性瘢痕)，患者与观察者瘢痕评估表评分显示，患者对术后瘢痕改善效果满意，且组织学检测发现术前不存在皮脂腺和汗腺的瘢痕组织在注射后出现了皮脂腺和汗腺，推测可能是浓缩纳米脂肪中的ADSCs促进了皮脂腺和汗腺再生，促使瘢痕组织向正常皮肤转化。Gentile等[29]将Tonnard法纳米脂肪和三种改良纳米脂肪进行比较，并将四种纳米脂肪应用于43例烧伤或创伤后瘢痕患者，结果发现，增压改良的纳米脂肪中SVF水平最高，经过团队评估和患者自评后发现，增压改良的纳米脂肪可减轻瘢痕，临床评价最佳，且纳米脂肪中SVF水平与临床疗效呈正相关。动物实验中，Zhang等[30]在增生性瘢痕模型的兔耳内注射ADSCs，发现ADSCs可通过减少α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原基因的表达，改善胶原蛋白沉积，减轻兔耳增生性瘢痕的形成。

脂肪组织来源细胞再生技术在减轻瘢痕的应用中作用显著，但由于很难确定每种再生技术的有效剂量，无法并列比较它们临床作用的优劣。但多项对比研究显示，瘢痕效果的改善与SVF水平密切相关，相较于ADSCs，SVF的临床效果更佳[16，31-32]。ADSCs单独应用时不具备体积填充的作用，因此不适用于凹陷型瘢痕等瘢痕类型的治疗，而纳米脂肪及SVF因富含ADSCs，可起到纠正轻微体积缺损等作用，因而应用范围更广泛。调整纳米脂肪的制备程序后发现，纳米脂肪制备中任何一个步骤的改变均可影响SVF的水平，继而改变临床效果[29]，提示未来应进一步详细分解纳米脂肪制备过程，在制备流程简易化的同时寻求SVF的高产量。此外，Vallejo等[33]认为，脂肪填充时由于脂肪内的ADSCs具有旁分泌等作用，可能会干扰肿瘤生物学，因此将脂肪填充应用于恶性肿瘤切除术后的瘢痕患者时，难以排除ADSCs由于分泌生长因子等而引起肿瘤复发的可能。而鉴于ADSCs是脂肪组织来源细胞再生技术的核心成分，研究者应针对ADSCs对肿瘤生物学的影响加强基础研究，明确脂肪组织来源细胞再生技术的禁忌证。

2.2面部年轻化 皮肤老化主要表现为皱纹、色素沉着、皮肤松弛萎缩等，这些表现主要由内在因素(基因、激素)和外在因素(紫外线、吸烟)等共同造成[34]。脂肪组织来源细胞再生技术可促进胶原蛋白重新合成，减少弹性组织变性。Tonnard等[8]应用纳米脂肪注射治疗67例患者的浅表皱纹，疗效显著且术后未见感染、脂肪囊肿等并发症，仅在大面积注射部位出现短暂红斑，但仅持续1.5～2 d，提示纳米脂肪可促进正常的真皮和表皮基质结构的恢复；另外，应用纳米脂肪治疗黑眼圈也取得了良好的效果。然而，考虑到不同分型黑眼圈病因有所不同，李聪等[35]认为，纳米脂肪仅对血管性黑眼圈和部分结构性黑眼圈疗效显著，而对于色素性黑眼圈以及混合型黑眼圈疗效有限。

Wei等[36]比较了62例联合应用纳米脂肪、富血小板纤维蛋白和结构脂肪移植的试验组患者和77例接受传统自体脂肪移植的对照组患者，结果发现，纳米脂肪参与的试验组面部软组织凹陷症状和皮肤质地均较传统脂肪移植组有较大改善，纳米脂肪组总体满意率达90%以上，且移植区脂肪组织长期存活，多数患者无须多次重复注射。随后，Liang等[37]比较了接受纳米脂肪和皮内富血小板纤维蛋白联合注射的103例面部皮肤老化患者和接受透明质酸注射的128例面部皮肤老化患者的治疗效果，结果显示，接受纳米脂肪和皮内富血小板纤维蛋白联合注射的患者面部皮肤老化的改善大于接受透明质酸注射者，考虑可能是富血小板纤维蛋白可持续释放生长因子，刺激ADSCs的增殖和旁分泌功能，增加了真皮生长因子的浓度。Amirkhani等[34]给16例患者的鼻唇沟注射了自体SVF，并评估注射后鼻唇褶的改善情况，结果发现，SVF治疗后皮肤真皮密度和厚度均显著增加；值得注意的是，注射后1周内并未检测到注射细胞，表明SVF的旁分泌机制主要负责真皮结构的变化，而并不参与构成组织的结构成分，由此推测，SVF治疗效果的一个潜在机制可能是补充CD44，CD44是一种透明质酸受体，CD44的减少与皮肤老化相关，可导致真皮层密度降低。

在动物实验中，Zheng等[38]成功建立光老化裸鼠模型，并将每只小鼠背部分为4个区域，随机注射传统纳米脂肪、离心后中间层纳米脂肪、离心后下层纳米脂肪或0.9%氯化钠注射溶液，结果发现，离心后下层纳米脂肪中SVF及ADSCs的浓度最高，改善小鼠光老化效果最佳。由于纳米脂肪和SVF中均不含成活的脂肪细胞，目前面部年轻化的进展得益于再生医学中的干细胞移植技术。虽然脂肪组织来源细胞再生技术对面部年轻化具有积极疗效，但从脂肪组织中分离ADSCs和SVF涉及酶消化，需对其生产过程严格监管。与ADSCs和SVF相比，纳米脂肪注射除了具备再生潜能，还具有嘴唇、眼睑等精细部位的体积填充作用，因此在面部年轻化领域中的应用备受瞩目。

3 小 结

纳米脂肪、SVF、ADSCs等脂肪组织来源细胞均具有强大的组织再生和修复能力。与面部老化的其他治疗方法相比，脂肪组织来源细胞再生技术可更好地主动预防衰老并维持疗效。三种细胞再生技术各具特点，但与制备SVF和ADSCs的复杂操作以及高昂的制备费用相比，纳米脂肪因制备过程简单、便捷，无化学试剂及酶污染风险而格外具有优势[14]。目前由于缺乏标准的脂肪组织来源细胞的命名法，且疗效评估方法较为多样，导致脂肪组织来源细胞再生技术的临床应用受到诸多限制。此外，脂肪组织来源细胞再生技术在减轻瘢痕、促进面部年轻化等方面的作用机制尚不明确，未来仍需进一步研究。