阴阳共调汤干预绝经后骨质疏松小鼠的实验研究

陈艺缘，张茂云，孙 睿，梁健峰，白潇娴，王柏淇，刘宏岩，郭军鹏，钱婷婷，刘岩松

（长春中医药大学，长春 130117）

骨质疏松症是一种全身性骨病，表现为骨组织微结构损伤和骨量减少，骨脆性增加导致骨折易发，尤其以绝经后的女性和老年男性最为多见[1]。绝经后骨质疏松症（PMPO）是由于绝经后卵巢功能衰退引起雌激素水平分泌降低的一种代谢性疾病[2]，致使患者易骨折，严重可致残甚至致死。目前临床上治疗绝经后骨质疏松症主要以抑制骨吸收药物、促进骨形成药物、骨矿物药物为主，如雌激素、钙剂、甲状旁腺素等。这些药物在临床上有着良好的效果，但此类药物大多需要长时间服用，这种服药方式会带来很多不良反应，如雌激素的长时间应用会提高罹患子宫内膜增生、子宫内膜癌、乳腺癌等疾病的发生概率[3]，除此外还有增加异常子宫出血、卵巢癌等风险[4]。为降低雌激素等治疗药物带来的不良反应，同时有效干预绝经后骨质疏松症，近年来中医学界对于治疗绝经后骨质疏松的研究颇多，如何更好地防止绝经后骨质疏松症成为研究的热点。

中医学中并没有绝经后骨质疏松症这一病名，根据其临床表现将其划归为“骨痿”“骨枯”“腰痛”等范畴[5]。中医认为，本病发病缓慢，《素问·上古天真论篇第一》：“七七，任脉虚太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子。”绝经后天癸竭，以致肾精亏虚，日久髓海空虚是该病之病机。治疗大多以“滋阴、补肾、健脾”[6]立著。笔者在研究中发现，绝经后妇女虽以阴虚多见，但临床多以阴阳两虚之证候同时出现，当以“阴阳共调”论治。本实验通过去卵巢术建立绝经后骨质疏松小鼠模型，对比阴阳共调汤、雌激素、金匮肾气丸汤剂、六味地黄汤对绝经后骨质疏松小鼠的影响，进行该项动物实验，以期提供动物实验数据，为以后研究提供新依据，为临床提供新思路。

1 材料

1.1 实验药物 阴阳共调汤由熟地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮12 g，葛根12 g，龟板9 g，女贞子12 g，淫羊藿12 g，巴戟天12 g 组成；金匮肾气丸汤由生地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，桂枝3 g，炮附子3 g组成；六味地黄汤由熟地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，泽泻9 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g 组成。所有药物均来自于长春中医药大学附属医院中药房，3 种中药剂根据小鼠与人体质量1:0.035 比例配比，煎煮时予8 倍水、6 倍水6 次浓缩至30 mL。对照组予补佳乐1 mg 配比溶液。

1.2 实验动物 3 月龄SD 雌性小鼠60 只，体质量（20±7.7）g。所有小鼠均购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，常规饲养于长春中医药大学动物实验室。

1.3 实验仪器 苏木素液，伊红染色液，梯度浓度乙醇，二甲苯，多聚甲醛，青霉素，羧甲基纤维素钠，超纯水等。石蜡包埋机（HIS-TOCENTRE），石蜡切片机（FINESSE），HPIAS-1000 高清晰度彩色病理图文分析系统，奥林巴斯BX40显微镜，小动物骨强度仪。

2 方法

2.1 造模 除假手术组、模型组外，其余各组小鼠以1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，行双侧卵巢切除术。卵巢切除术：1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，将小鼠仰卧于手术台上，四肢固定，腹部正中偏下处备皮，络合碘消毒，切开皮肤，于腹白线依次切开肌肉，剪开腹膜进入腹腔，可见乳白色组织。轻轻将之拉出腹腔,即可见被包裹的粉红色高粱米大小“桑葚样”卵巢，分离后钳夹、结扎，剪去卵巢，检查有无渗血，分层缝合皮肤，络合碘切口消毒。待麻醉苏醒。小鼠术后均口服青霉素混悬液（2 万U/mL）抗感染，连续3 d。常规饲养,自由饮水摄食，并注意观察小鼠的情况。

2.2 剂量及灌胃 在小鼠接受造模处理后第31 天，进行药物干预。阴阳共调汤组、金匮肾气丸汤剂组、六味地黄汤组分别予对应药剂0.3 mL 灌胃；对照组给予补佳乐混悬液0.3 mL；假手术组、模型组口服等体积的超纯水。每日1 次，连续给药90 d。

2.3 取材 第91 天采取断头法处死小鼠，处死前一晚断粮供水，在无菌操作下剥离子宫，称其重量，剪断双侧胫骨、股骨，分离肌肉，测量骨强度值，胫骨、股骨脱钙2 周处理，切片染色以观察骨小梁、干骺端。

2.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学处理，计量资料以均值±标准差（x±s）表达，组间数据比较采用单因素方差分析；技术资料采用卡方检验。

3 结果

3.1 绝经后骨质疏松小鼠模型体质量变化 分别测定小鼠术后30、60、90 d（处死前）的体质量变化，如表1。术后30天与模型组相比，各组小鼠体质量无显著差异；术后60 天，与模型组相比，对照组体质量增高、金匮肾气丸汤剂组体质量降低，均有显著差异；术后90 天（处死前），与模型组相比较，阴阳共调汤剂组与六味地黄汤剂组体质量降低，有显著差异，与对照组相比较，阴阳共调汤剂组没有显著差异。

表1 绝经后骨质疏松小鼠模型体质量变化 g

3.2 绝经后骨质疏松小鼠子宫重量 分别测定小鼠处死后的子宫重量，如表2。与模型组相比较，对照组与阴阳共调汤剂组子宫重量增高，有显著差异；与对照组相比较，阴阳共调汤剂组无显著差异。

表2 绝经后骨质疏松小鼠子宫重量

3.3 绝经后骨质疏松小鼠骨强度值 取右侧股骨，放置于小动物骨骼强度测定仪上，根据骨压碎最大荷载压力，测定骨骼强度，如表3。

表3 绝经后骨质疏松小鼠骨强度值 kg

3.4 HE 染色小鼠股骨、胫骨冠状面光镜图 分别在4倍镜、10 倍镜下观察骨小梁与干骺端，如图4、5、6、7。从图可看出，在4 倍镜、10 倍镜下，可以看出，假手术组骨细胞内含量丰富，干骺端骨量正常分布，骨小梁排列规律，胫骨、股骨细胞中无空洞现象，结构紧密，密度正常。模型组的胫骨和股骨细胞内可见多处空洞、骨小梁断裂、干骺端骨量流失且分布不均匀，骨组织明显减少，结构疏松，证明双侧卵巢切除术可以模拟绝经后骨质疏松这一模型。与模型组相比，阴阳共调汤剂组的股骨与胫骨的骨小梁之间联系更为紧密，排列更有规律，而模型组骨小梁稀疏纤细，有断裂、分层；与模型组相比较，干骺端骨量明显增多。

4 讨论

图4 4 倍镜下股骨骨小梁与干骺端

图5 10 倍镜下股骨骨小梁与干骺端

图6 4 倍镜下胫骨骨小梁与干骺端

图7 10 倍镜下胫骨骨小梁与干骺端

中医认为，绝经后骨质疏松症由多种病机所致，以肾精亏虚为本，同时与肝脾两脏有关[7]。“肾主骨，生髓。”骨髓的充盈依赖于肾精的滋养，从而使骨骼强健有力[8]。李建国认为，女子以肝为先天，女性的特殊生理、病理都与肝的关系极为密切，女性的生理特点决定了其易于引起肝血亏虚之证，导致肝藏血及疏泄功能失职，引发阴虚血亏，不能濡养筋骨[9]；绝经后妇女脾气亏虚，气血生化无源，无以填充骨髓，则骨枯髓减，四肢废痿[10]。但笔者在临床中发现，绝经后骨质疏松症阴阳两虚者甚多。“天癸至，月事以时下；天癸竭，地道不通”，彭勋潜认为女子来潮、绝经都与天癸有着密不可分的关系，天癸竭则月经竭，进而发生绝经后骨质疏松症[11]。“天癸竭”主要表现为肾阴虚、肾阳虚或阴阳俱虚等临床表现[12]。周艳认为，阴阳失衡则诸证峰起[13]。阳存于阴，阴存于阳，“孤阴不生，独阳不长”，阴阳互根互用，双方具有互相滋生、促进的作用，同时也会“阳损及阴，阴损及阳”，故而绝经后妇女易于出现阴阳两虚之证，在治疗上施以“阴阳共调”之法，以期使阴阳复交，正气盛则病自去[14]。

本实验采用的去卵巢骨质疏松模型是目前最常用的绝经后骨质疏松动物模型[15]。该模型采用手术切除小鼠双侧卵巢的方法后，其骨代谢活跃，骨量明显丢失；雌激素水平下降，骨密度值降低，较好的模拟了女性绝经后骨质疏松的雌激素水平下降，骨密度值下降，骨强度值下降，骨量丢失加速，钙、磷等矿物质代谢紊乱，破坏了骨形成与骨吸收间的骨代谢平衡，破骨细胞吸收的骨量大于成骨细胞形成的骨量，导致净骨量丢失的特点[16]。

目前临床上治疗绝经后骨质疏松症的药物主要有雌激素补充剂、雷洛昔芬[17]、降钙素[18]等，并且有相关研究表明维生素D 可以调节钙磷及骨代谢[19]。

本实验探究阴阳共调汤对绝经后骨质疏松小鼠骨强度、骨小梁、干骺端等指标的影响。病理切片提示阴阳共调汤剂组与对照组干预绝经后骨质疏松小鼠有良好的效果，可以明显改善骨质疏松的病理形态，增加骨小梁面积和厚度、增加干骺端的骨量；骨强度提示阴阳共调汤剂组与对照组能够显著提升小鼠的股骨强度，提高荷载能力。阴阳共调汤剂组与对照组各项指标并无显著差异，可以认为，阴阳共调汤与雌激素效力相当。相较于雌激素的使用，阴阳共调汤可以降低致癌或静脉血栓[20]等不良反应，更为安全、健康。研究结果可以为绝经后骨质疏松的临床提供新的理论依据及实验基础。