苹果酵素自然发酵工艺优化及品质分析

张海燕，康三江*，袁 晶，曾朝珍

（1.甘肃省农业科学院 农产品贮藏加工研究所，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省果蔬贮藏加工技术创新中心，甘肃 兰州 730070）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人来食用的酵素产品[1-2]。其在含有植物本身的多种维生素、酶和矿物质等营养物质的同时，还通过微生物发酵产生新的次生代谢物及活性成分，与直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有机小分子更为浓缩，而且更容易为人体所吸收，这正是酵素的魅力所在，也是研究热点。大量研究表明，这些物质从细胞层面调节机体的生命活动，具有抗氧化[3-5]、降血脂及减肥[6-7]、提高免疫力[8-9]、解酒与护肝[10]、抑菌[11]、改善肠胃功能[12-13]等功效。但是，由于目前许多酵素的生产工艺不规范，发酵过程控制不科学，使得产品中代谢物的代谢通路以及代谢终产物难以确定，同时各类酵素产品成分复杂，作用机理尚不明确。因此，食用酵素的生产工艺以及产品质量控制都有待进一步的发展与研究。

苹果因其优良的感官特性和糖类、蛋白质、有机酸、维生素及苹果多酚等丰富的营养成分而成为全球最受欢迎的水果之一[14]，具有抗氧化、延缓衰老和增强免疫力等功效[15]。目前，苹果对健康的影响主要归因于其酚类化合物含量高，酚类物质在抑制肿瘤、防止冠心病等方面具有很高的生理活性[16]。自然发酵体系是酵素食品开发应用的基础和微生物多样性研究的重要来源[17]，该技术作为酵素产品制作工艺的重要环节之一，可产生多种酶、短链脂肪酸、醇、酯等次级代谢产物，亦可能将原料的某些成分转化成高活性物质，因而产品的风味比较特殊[18]。以苹果为原料，经天然发酵的苹果酵素的抗氧化活性和代谢产物均有提高[19-20]，崔国庭等[21]采用响应面分析法优化了苹果酵素纯种发酵工艺，同时对其体外抗氧化活性和酶活性的变化进行了分析，但有关苹果酵素自然发酵工艺及品质变化的研究尚未见报道。因此该研究以苹果为原料，以pH值、可溶性固形物、总酸、感官评价、还原力、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和酚类物质等指标为衡量标准，探究苹果酵素品质变化，并通过响应面法优化苹果酵素自然发酵工艺，以期为苹果酵素产品质量控制和指导生产实践提供部分理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富士苹果（长富2号）：采自甘肃省庆阳市有机苹果基地；果糖：市售；纯净水：本实验室自制；三羟甲基氨基甲烷：上海源叶生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、盐酸、氢氧化钠、酚酞、乙醇、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、Tris、甲醇和乙腈等（均为色谱纯）：中瑞化学试剂公司；芦丁、槲皮素-半乳糖苷、槲皮素-葡萄糖苷、槲皮素-木糖苷、槲皮素-呋喃阿拉伯糖苷、鼠李糖苷、槲皮素-吡喃阿拉伯糖苷、根皮苷、绿原酸、隐绿原酸、原花青素B1、原花青素B2、原花青素C1、儿茶素、表儿茶素标准品（纯度＞98%）：美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

Waters Xevo TQ-S IVD超高效液相色谱串联三重四级杆质谱系统，配置Acquity PDAeλ二极管阵列检测器、Waters ACQUITY UPLC®HSST3色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）：Waters上海科技有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计：上海凌析达仪器有限公司；LRH-70 型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-75G 型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DK-S24 数显恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；MIRCOCL 17R离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；超低温冰箱：青岛海尔集团；DL-CJ-1N超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；PB-10型精密pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 苹果酵素制备工艺流程及操作要点

苹果原料选择→清洗→去核→切分→装罐→加水→调节糖度、pH→发酵→过滤→成品

操作要点：新鲜苹果用纯净水冲洗干净，沥干水分后去核并切分成3～5 mm的片，冰糖破碎后用紫外灯辐照处理30 min，将苹果片与纯净水的按设置好质量比加入无菌酵素发酵罐中，根据设置好的糖添加量加入冰糖调节糖度，用柠檬酸和NaOH调节，置于阴凉干燥的发酵车间，在常温（20～26 ℃）条件下自然发酵3个月，发酵第一个月隔天搅拌通气，之后密封发酵，发酵结束取上清液进行指标测定。

1.3.2 苹果酵素自然发酵工艺优化

（1）发酵工艺对苹果酵素品质的影响

分别考察初始pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、糖添加量（0、5%、10%、15%、20%）、苹果片质量浓度（100 g/L、200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L）对苹果酵素发酵过程中pH值、可溶性固形物、总酸、感官评价、还原力和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指标的影响，确定发酵工艺对苹果酵素品质的影响效果，并筛选适宜范围进行响应面优化试验，重复3次。

（2）响应面试验设计

采用Box-Benhnken模型试验设计原理[22]，以初始pH值、糖添加量、苹果片质量浓度为自变量，以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，以苹果酵素产品的感官评价（Y1）和SOD活性（Y2）为响应值，进行3因素3水平响应面分析，试验重复3次，优化苹果酵素自然发酵工艺条件，响应面试验因素水平编码见表1。

表1 发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation process optimization

1.3.3 理化指标

pH值的测定：采用pH计法测定；总酸的测定：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》方法；可溶性固形物含量的测定：采用糖度计法测定。

1.3.4 感官指标的测定

依据GB/T 16291.1—2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则第1部分：优选评价员》要求，筛选出6名评价员组成感官评价小组，对其进行苹果酵素的感官评价培训，并根据QB/T 5323—2018《植物酵素》中食用植物酵素的规定对苹果酵素的色泽、组织形态、滋味、气味、杂质等应用9点标度法[23]进行感官评价，见表2。评价时采用3位数字随机编码保证样品提供的一致性，以随机的顺序提供，评价小组3次重复后的平均分为指标定量结果（满分9分）。

表2 苹果酵素感官评价描述词标度Table 2 Sensory attributes descriptors and intensity scale of apple enzyme

1.3.5 还原力测定

参照肖梦月等[24]的测定方法，有改动。取苹果酵素发酵液0.2 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6）和1.0 mL 10%的铁氰化钾溶液，于50 ℃水浴20 min后快速冷却，再加入2.5 mL 20%的三氯乙酸溶液后，于3 600 r/min离心20 min后立即取上清液1.5 mL，加入去离子水1.5 mL和0.1%三氯化铁0.5 mL。以去离子水作参比在波长700 nm处测定吸光度值（OD700nm值）。吸光度值越大，说明还原能力越强，抗氧化效果越好。重复3次，取平均值。

1.3.6 SOD活性的测定

参照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶活性》。

1.3.7 酚类化合物的测定

采用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）及液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）进行测定，参照李静等[25]的方法。依次用5 mL甲醇和5 mL活化C18固相萃取小柱，倒入样液，用5 mL超纯水分2次淋洗固相萃取小柱，弃除淋洗液，再用4 mL甲醇分2次淋洗固相萃取小柱，收集淋洗液，最后用甲醇定容至5 mL，过0.22 μm有机相滤膜，待分析。质谱条件：离子源温度为150 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，脱溶剂气流量800 L/h，锥孔气流速50 L/h。超高效液相色谱条件：柱温为40 ℃，流速为0.3 mL/min，进样量为2.0 μL，流动相A为乙腈，流动相B为0.5%的甲酸溶液，梯度洗脱，A液：0%（0 min）→10%（1 min）→25%（16 min）→40%（18 min）→100%（19 min），20 min回到初始状态，平衡5 min。扫描波长参数设定为210～600 nm，通道为280 nm、320 nm和360 nm。

1.3.8 统计学处理

每组试验重复3次，试验数据采用Excel 2010、SPSS 22.0数据分析软件进行分析处理及作图，Box-Behnken设计采用Design Expert 8.0.6软件并进行响应面分析，试验结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺对苹果酵素品质的影响

2.1.1 初始pH值对苹果酵素品质的影响

pH值、可溶性固形物、总酸等是衡量酵素发酵成熟的主要指标，感官评价、还原力和SOD活性等也是反映酵素品质的重要指标。由图1（A）可知，随着初始pH值的升高，苹果酵素产品的pH值和可溶性固形物均呈先降低后升高趋势，pH 4.5时最低，分别为3.06和3.4°Bx，但对产品pH值的影响较小，在3.06～3.24之间；总酸含量则呈反向趋势，先升高后降低，pH 4.5时达到峰值，为2.91 g/L。由图1（B）可知，随着初始pH值的升高，产品的感官评分、还原力以及SOD活性均呈先升高后降低的趋势，pH 4.5时达到最大值分别为7.41分、2.14（OD700nm值）、41.53 U/mL，均高于pH 4.0和pH 5.0条件下发酵的。说明pH值过高或过低均会抑制微生物的生长以及酶的活性，进而影响pH值、可溶性固形物、总酸、感官评价、还原力以及SOD活性等指标的变化，pH 4.5的发酵环境适合苹果酵素自然发酵微生物快速繁殖和生长代谢，有利于提高碳水化合物的利用率，使得发酵液中可溶性固形物降低，增强还原力和SOD活性，同时由于乳酸、乙酸、苹果酸等有机酸含量增加，引起总酸含量增加，pH值降低。综合选择适宜的初始pH 4.0～5.0进行后续试验。

图1 初始pH值对苹果酵素品质的影响Fig.1 Effect of initial pH on apple enzyme quality

2.1.2 糖添加量对苹果酵素品质的影响

不同糖添加量对苹果酵素品质的影响见图2。由图2（A）可知，发酵液中不添加糖时，苹果酵素产品的pH值较高，为3.55，可溶性固形物和总酸含量均较低，分别为3.4°Bx和0.82 g/L，随着糖添加量的增加，pH值呈先降低后升高的趋势，糖添加量15%时最低，为3.03；可溶性固形物则随着糖添加量的增加而逐渐升高；总酸的变化趋势为先升高后降低，糖添加量15%时达到最大值3.24 g/L，高于糖添加量为10%和20%的。由图2（B）可知，感官评分和SOD活性的变化在0～15%之间呈上升趋势，其中在糖添加量为15%时达到最大分别为7.29分和33.12 U/mL，之后随着糖添加量增加逐渐下降；而还原力则随着糖添加量的增加而一致增大，与肖梦月等[24]的研究结果一致。说明发酵液中糖添加量过高或过低，都可能会严重影响微生物的生长和产物的合成，糖添加量过低，发酵不完全，pH值较高，产物少，总酸、感官评价、还原力和SOD活性等不高；糖添加量过高，发酵液的渗透压增加，微生物正常生长代谢受到抑制，发酵进程不能顺利进行，pH值下降受阻，总酸、感官评价、还原力和SOD活性等均受到影响。综合选择适宜的糖添加量10%～20%进行后续试验。

图2 糖添加量对苹果酵素品质的影响Fig.2 Effect of sugar addition on apple enzyme quality

2.1.3 苹果片添加量对苹果酵素品质的影响

图3 苹果片含量对苹果酵素品质的影响Fig.3 Effect of apple slices concentration on apple enzyme quality

由图3（A）可知，苹果片含量在100～200 g/L时，pH值、可溶性固形物呈下降趋势，苹果片含量在200 g/L时最低，分别为3.06和4.2°Bx，之后随着苹果片质量浓度的增加逐渐上升；而总酸的变化趋势正好相反，在苹果片含量为200 g/L时达到最大值3.99 g/L。由图3（B）可知，感官评分、还原力和SOD活性均随苹果片含量的增加呈先升高后降低趋势，当苹果片含量为200 g/L时最高，分别为7.6分、2.18（OD700nm值）、32.28 U/mL。这可能是由于加水会降低发酵体系中的糖浓度而降低高渗透压，并升高发酵液pH值，降低二者对微生物生长和发酵的影响，但只有在适宜的苹果片质量浓度下苹果酵素才能发酵完全，保证产品品质，继续增加加水量，会使发酵体系中糖浓度过低，pH值过高，不利于发酵。综合选择适宜的苹果片含量为100～300 g/L进行后续试验。

2.2 苹果酵素自然发酵工艺响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

基于单因素试验结果分析，选择初始pH值、糖添加量、料液比为影响因素，以感官评价和SOD活性为响应值，对酵素自然发酵工艺条件进行3因素3水平的响应面分析，试验设计及结果见表3。

表3 发酵工艺优化响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation process optimization

2.2.2 回归模型的建立与方差分析

利用Design-Expert 8.0数据分析软件对所得试验数据进行多元回归分析，得到感官评价（Y1）和SOD活性（Y2）对自变量初始pH值（X1）、糖添加量（X2）、苹果片质量浓度（X3）的二次多项回归模型方程分别为：

表4 以感官评分为评价指标回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model using sensory evaluation as evaluation index

对感官评价的回归模型进行方差分析，结果见表4。由表4可知，回归模型差异极显著（P＜0.000 1），失拟项P值为0.892 2，无显著性影响（P＞0.05），回归方程的决定系数R2=0.994 2，调整决定系数R2Adj=0.986 8，说明该模型能够解释99.92%的变化，设计的预测值和试验值相近，该模型对苹果酵素自然发酵工艺优化试验拟合程度较好。结果表明，X1、X2、X3、X1X3、X2X3、X12、X22、X32对苹果酵素感官评价的影响均达到了极显著水平（P＜0.01），X1X2对苹果酵素感官评价的影响显著（P＜0.05），各因素的影响依次为初始pH值（X1）＞糖添加量（X2）＞苹果片质量浓度（X3）。

对SOD活性的回归模型进行方差分析，结果见表5。结果见表5。回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P值为0.556 7，影响不显著（P＞0.05），回归方程的决定系数R2=0.997 5，调整决定系数R2Adj=0.994 2，说明该模型能够解释99.93%的变化，预测值和试验值之间有较好的相关性，该模型对苹果酵素自然发酵工艺优化试验拟合程度较好，可用该回归方程预测苹果酵素自然发酵工艺条件。结果表明，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X22、X32在苹果酵素自然发酵工艺优化中对SOD活性的影响极显著（P＜0.01），各因素的影响依次为初始pH值（X1）＞糖添加量（X2）＞苹果片含量（X3）。

表5 以超氧化物歧化酶活性为评价指标回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model using superoxide dismutase activity as evaluation index

2.2.3 最佳条件预测及验证试验

通过Design-Expert 8.0软件进行最大值分析，苹果酵素自然发酵对感官评价的最佳工艺条件为：初始pH值4.63，糖添加量15.08%，苹果片含量198.74 g/L，对SOD活性的最佳工艺条件为：初始pH值4.64，糖添加量14.85%，苹果片含量194.62 g/L，上述条件下，苹果酵素感官评分和SOD活性的理论最大值分别为8.61分和41.83 U/mL。结合实际情况，将工艺调整为初始pH值4.6，糖添加量15%，苹果片含量200 g/L，并为了确保所建回归模型的准确性，在此条件下进行验证，试验重复3 次，苹果酵素感官评分的平均值（8.45±0.24）分，SOD活性（40.26±1.03）U/mL，与预测值的相对误差较小，说明该模型准确可靠。

2.2.4 响应曲面图分析

初始pH值、糖添加量和苹果片含量中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对苹果酵素感官评价和SOD活性影响的响应面图见图4。响应曲面图可以直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，响应曲面坡度越陡峭，表明该因素对响应值的影响越敏感；反之，坡度相对平缓，表明处理条件对响应值的影响较小[26]。

如图4所示，初始pH值和糖添加量、初始pH值和苹果片质量浓度、糖添加量和苹果片质量浓度之间的交互作用均较明显，在试验考察范围内，各因素对苹果酵素感官评价和SOD活性的影响由大到小依次为：初始pH值（X1）＞糖添加量（X2）＞苹果片含量（X3），结果与方差分析一致。

图4 各因素对苹果酵素感官评价和超氧化物歧化酶活性影响的响应面图Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory evaluation and superoxide dismutase activity

2.3 苹果酵素酚类物质的组成与含量研究

采用超高效液相色谱（UPLC）及液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对苹果酵素中的酚酸类化合物进行测定，结果见表6。

表6 苹果酵素中酚类物质的组成与含量Table 6 Composition and contents of phenolics in apple enzyme

由表6可知，苹果酵素中共检出了15种酚类物质，其中有6种为槲皮素衍生物，这是一类在植物中广泛分布的天然生物活性物质，具有降糖降脂功效[29]；绿原酸含量最高，为12.72 mg/L，这可能与苹果中的绿原酸含量较高有关系[28]，原花青素B2、表儿茶素、原花青素B1含量较高，分别为4.86 mg/L、4.17 mg/L、3.34 mg/L，槲皮素-半乳糖苷、儿茶素以及根皮苷次之，分别为2.69 mg/L、1.80 mg/L、1.03 mg/L，它们共同构成苹果酵素中主要的酚类物质。有研究表明，根皮苷是苹果中特有的酚类物质，具有抗癌、降血糖、改善记忆力等多种生物活性[29]，而且绿原酸、根皮苷以及表儿茶素是苹果中主要的酚类物质[30]。因此，除绿原酸外，其它酚类物质的变化与原料的关系，以及苹果酵素自然发酵过程中酚类物质的变化规律有待于进一步研究。

3 结论

通过单因素和响应面优化试验，得出初始pH值、糖添加量、苹果片质量浓度等因素对苹果酵素感官评分和SOD活性的影响显著，优化出苹果酵素自然发酵工艺条件为初始pH值4.6，糖添加量15%，苹果片含量200 g/L，在此条件下苹果酵素感官评分的平均值（8.45±0.24）分、SOD活性（40.26±1.03）U/mL，与模型预测值误差较小。

苹果酵素检测出15种酚类物质，其中绿原酸含量最高，原花青素B2、表儿茶素、原花青素B1含量较高，槲皮素-半乳糖苷、儿茶素以及根皮苷次之。