促烟草种子萌发的细菌菌株筛选及促生特性研究

彭玉龙，张乾申，韩丽珍*，孟 源

（1.贵州省遵义市烟草公司，贵州 遵义 563000；2.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025）

烟草是我国重要的经济作物，种植面积已经超过130 万hm2，居世界首位[1]。在烟草栽培中，提高烟苗素质、培育无病壮苗是优质烟叶生产的基础；而如今烤烟育苗普遍存在烟苗参差不齐、移栽缓苗时间较长的状况。因而，提高烟草种子萌发率、增强幼苗生长能力对提高烟叶质量意义重大。从不同植物组织、根际或土壤中分离的有益细菌可以通过合成促进植物根系生长发育的吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）和与植物根际营养相关的铁载体，溶解土壤中的难溶性磷钾等促进幼苗的生长[2]。芽孢杆菌具有分泌IAA 等促生特性，已作为重要的微生物资源，在生物肥料领域备受关注。闫寒等[3]发现从吉烟9 号烤烟的根、茎、叶分离到的优势内生细菌菌株为芽孢杆菌属，这与黄智华等[4]、刘晓璐等[5]的报道相一致。而从攀枝花烤烟分离到的62 株内生固氮菌中，有6 株芽孢杆菌菌株还具有产IAA 的能力[6]。本项目组在前期研究中，为了解决贵州植烟土壤黏重、增施有机肥后土壤氮素生物有效性不高的问题，从贵州烟区土壤中已经筛选到2 株高效的氨化芽孢杆菌菌株BacillustoyonensisAMM-2 和B.mobilisAMM-5[7]，但其是否具有促生能力尚未可知。此外，实验室前期从茶树根际分离获得可促进白菜、花生生长的5 株细菌菌株。本文拟利用7 株细菌菌株对烟草种子进行浸种处理，筛选可促进种子萌发的菌株，并进一步研究其促生特性，为获得高质量无病烟苗提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试种子 供试烟草种子为烤烟主栽品种K326。

1.1.2 供试菌株 7 株细菌菌株均为本实验室分离，包括Bacillus toyonensisAMM-2，Bacillus mobilisAMM-5，放射性土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）KKS-6-N1，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HP9，坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）HP10，贪铜菌属（Cupriavidussp.）WP9，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）HGD3。

1.1.3 培养基 LB 培养基、NBRIP 培养基、MKB培养基及CAS 检测平板。

1.2 方法

1.2.1 烟草种子萌发试验 将7 株菌株活化、转接入LB 液体培养基中，30 ℃、150 r/min 摇床振荡培养24 h，调节菌悬液OD600值至0.5（活菌数约108cfu/mL）备用。选择大小一致均匀饱满的烟草种子，经0.2% CuSO4溶液消毒15 min，去离子水冲洗，于不同菌株的菌悬液中浸泡2 h，无菌滤纸吸干后，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，每皿放置20 粒种子，每菌株设3 个重复，以LB 培养基为对照。光照培养箱中培养14 d[8]，补充无菌水保持滤纸湿润。每天统计种子发芽粒数，计算发芽势、发芽率和发芽指数；于14 d 时测定每个发芽幼苗的苗长并计算活力指数[9]。

1.2.2 菌株溶磷能力测定 挑取各菌株的单菌落点种于NBRIP 培养基平板上，30 ℃培养3 d，观察是否有溶磷圈。将具溶磷能力的菌株转接至NBRIP 液体培养基中，摇床振荡培养7 d，以不接菌培养基为对照，每处理重复3 次。培养液经4000 r/min 离心25 min、取适量上清液以钼蓝比色法测定可溶磷含量，溶磷量为培养7 d 与1 d 可溶性磷含量之差[10]。

1.2.3 菌株产IAA 能力测定 将活化菌株接种于含L-色氨酸（100 mg/L）的LB 培养基中、振荡培养24 h 后，取100 μL 培养液加入等体积Salkowski比色液、避光30 min 进行定性分析，颜色变红者为阳性。定量测定时，取离心的24 h 菌株培养液上清，按上述方法反应并测定OD530值，根据IAA 标准曲线计算培养液的IAA 含量，每菌株3 个重复[11]。

1.2.4 菌株分泌铁载体能力测定 取10 μL 菌悬液滴加至平铺于CAS 平板的灭菌滤纸上、28 ℃培养48 h 进行定性分析，能分泌铁载体的菌落周围出现橙黄色透明圈[12]。定量测定时，挑取菌落接种于MKB 培养基中，28 ℃振荡培养48 h 后，离心收集上清，与CAS 检测液等体积混匀后静置1 h，测定630 nm 处的吸光值（As），以超纯水为对照；MKB培养基相应反应的OD630值为参比值（Ar），铁载体分泌活性=[(Ar-As)/Ar]×100%[13]。

1.3 数据统计分析

以SPSS 20.0 软件分析数据，使用Duncan 法进行组间差异显著性检验。

2 结果

2.1 不同细菌菌株浸种对烟草种子萌发的影响

表1 结果显示，烟草种子发芽势显著高于对照的是AMM-2 和AMM-5 处理，显著降低的为WP9和HGD3 处理；且AMM-2 及AMM-5 发芽率较对照分别提高10.41%和12.50%。发芽指数表征发芽速率和种子活力，活力指数是种子发芽速率和生长量的综合反映，可更好地反映种子活力。就这两个指数而言，HGD3 菌株处理最低，而AMM-2 和AMM-5 菌株处理则显著高于对照，芽长较对照分别增长11.99%和12.50%。可见AMM-2 和AMM-5可以明显促进烟草种子萌发。

2.2 两株氨化芽孢杆菌菌株浸种对烟草种子发芽动态及幼苗形态的影响

对AMM-2 和AMM-5 菌株浸种处理的烟草种子发芽数进行动态追踪（图1），发现对照组和浸种处理组均在第4 天开始萌发，之后菌株浸种显著加快了种子的萌发速度，发芽数急剧上升，于处理后7 d达到最大萌发数；而对照组至10 d达到最大值，且发芽数远低于2 株菌株的处理组。萌发前期AMM-5 浸种的烟草发芽数略高于AMM-2，6 d 后已基本无差别。萌发14 d 时，2 个菌株处理组的幼苗较对照发育更为均匀一致（图2）。

表1 不同细菌菌株对烟草种子萌发相关指标的影响Table 1 Effects of different strains on germination related indexes of tobacco seeds

图1 两株氨化芽孢杆菌菌株浸种的烟草种子发芽数变化Fig.1 Dynamic variation of germinated seed numbers of tobacco soaking with two ammonifying Bacillus strains

图2 两株氨化芽孢杆菌菌株浸种14 d 时的烟草幼苗形态Fig.2 Seedling morphology of tobacco soaked with two ammonifying Bacillus strains for 14 days

2.3 两株氨化芽孢杆菌菌株促生特性的分析

结果显示，AMM-2 和AMM-5 菌株均可在含Ca3(PO4)2的NBRIP 平板上生长，且在菌落周围有明显的溶磷水解圈，表明菌株具有溶磷能力（图3A）；在CAS 平板上，与不产铁载体的大肠杆菌菌株相比，2 个菌株均可分泌铁载体，尤以AMM-2 菌株更为明显（图3B，3C）。定量测定结果表明（表2），2 个菌株的溶磷水平相当，在分泌IAA 及产生铁载体的能力上存在差别，AMM-2 菌株产生更高的IAA和铁载体。

图3 两株氨化芽孢杆菌菌株的溶磷及铁载体定性分析Fig.3 Quality analysis on phosphorus solubilization and siderophore of two ammonifying Bacillus strains

表2 不同细菌菌株的促生特性Table 2 Growth-promoting characteristics of different strains

3 讨 论

本研究利用7 株不同种属的细菌菌株进行种子萌发试验，包括4 株芽孢杆菌属菌株（HP9、HP10、AMM-2 和AMM-5）、1 株贪铜菌属菌株（WP9）、1株假单胞菌属菌株（HGD3）及1 株土壤杆菌属菌株（KKS-6-N1）。这7 株菌株除AMM-2 和AMM-5分离自烟区土壤，对其是否具促生特性未知外；其余5 株菌均分离自茶树根际，前期研究已经表明KKS-6-N1 具有固氮及分泌铁载体的特性，对白菜、空心菜及苋菜有促生效应[14]；具溶磷能力的HP9和HP10 可以显著促进花生幼苗的生长[15]。本试验中5 株具有促生特性的菌株对烟草种子萌发的影响不一，HGD3 抑制了种子的发芽、WP9 浸种的种子发芽势也显著低于对照，其余菌株的处理则与对照并无显著差异；明显促进烟草种子萌发的菌株仍是来源于烟区土壤的AMM-2 和AMM-5 菌株。相似的报道在大豆内生芽孢杆菌菌株、苎麻根围的伯克霍尔德氏菌菌株，及青稞根际分离菌株对来源植物的促种子萌发试验中被证实[16-18]。这些结果均表明本土土著微生物具有更好的促生作用，而其他环境来源的菌株由于其生态适应性不同[19]，对烟草的促生效果不同。

对烟草的促生研究大多利用盆栽试验。从贵州烟草根际分离的7 株产植物激素菌株对烟草有促生效果，其中3 株为芽孢杆菌属[20]。从烟草根际筛选的解钾PGPR 菌株也可显著促进幼苗的根系发育[2]。弯曲芽孢杆菌菌株提高了盆栽土壤的有效磷钾含量，促进了烟草生长[1]。而对于烟草种子萌发的影响研究则较少。席淑雅等[21]将烤烟根际分离的溶磷菌株加入育苗基质中用于烤烟漂浮育苗，发芽率较对照提高1.8%、烟苗生长指标高于对照。吴翔等[8]从四川烟区根际筛选到产IAA、铁载体和HCN 能力的促生菌，由Bacillus tequilensis，Enterobacter xiangfangensis，Klebsiella variicola以及肠杆菌科等4 株菌株构建的促生菌系可显著提高烟草种子的发芽率。本研究中，来自贵州烟区土壤的2 株芽孢杆菌菌株的浸种处理可显著提高种子的发芽势，较未接种对照提前3 d 达到最大萌发数，且14 d 时的幼苗表现更为均一，可明显减轻烟草萌发时参差不齐的状况，具有应用于漂浮育苗的潜力。而且，由于2 株菌株具有较强的分解有机氮能力及优良的促生特性，可考虑菌剂与有机肥复配，不仅可提高有机肥的氮素有效性，对于促进烟草的生长也有潜在的应用前景。

此外，研究表明可产生IAA 的菌株通过与植物的互作，能显著促进植株的生长[22]。从不同环境及植物根际分离的菌株产IAA 能力存在差异。据报道从棉花根际分离的8 株固氮菌，其IAA 产量为6.62～22.83 μg/mL[23]；从水稻中分离的55 株菌产IAA 的能力介于1～10 μg/mL[24]；而花生根际的10株固氮菌可分泌1.36～17.80 μg/mL 的IAA[25]。本研究获得的2 株氨化细菌菌株均可分泌IAA，其中AMM-2 菌株可产生21.57 μg/mL 的IAA，是一株产IAA 较高的菌株，其对烟草幼苗的生长及根系发育的影响有待于进一步研究。

4 结 论

利用5 株分离自茶树根际的PGPR 菌株、2 株分离自贵州烟区土壤的高效氨化细菌菌株浸种进行烟草种子萌发试验，发现来自烟区土壤的芽孢杆菌菌株Bacillus toyonensisAMM-2 和B.mobilisAMM-5 具有显著的促萌发作用，发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数均显著高于未浸种处理，且在处理后7 d 即达到最大发芽数，较对照提前了3 d。促生试验表明，AMM-2 和AMM-5 菌株具有溶磷、分泌IAA 及铁载体的能力，是2 株具有优良促生特性的高效氨化芽孢杆菌菌株，且AMM-2 具有更高的产IAA 和铁载体能力。