LncRNA MEG3在脓毒症患者血浆中的表达及其临床意义

袁超，金娜

(1.湖北省中西医结合医院重症医学科，武汉 430015；2.武汉市江夏区第一人民医院肿瘤内科，武汉 430000)

脓毒症是由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，其主要临床特征为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类转录长度超过200个核苷酸的长链RNA分子，可以调节相应靶基因的表达，影响疾病的发生、发展。有学者认为，某些LncRNA是脓毒症的良好诊断标志物或治疗靶点[1]。研究发现，脓毒症患者循环LncRNANEAT1与疾病风险增加、严重程度升高、预后不良以及促炎细胞因子的高表达密切相关[2]。LncRNA 母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)是一种抑癌基因。Chen等[3]研究发现，LncRNAMEG3在脓毒症中呈高表达，体外细胞实验证实，下调LncRNAMEG3表达可抑制肾脏和心脏等主要器官的细胞凋亡，LncRNAMEG3可能成为脓毒症的潜在治疗靶点。此外，LncRNAMEG3还被证实与感染和炎症相关疾病的进展有关。研究发现，被分枝杆菌感染后，巨噬细胞中LncRNAMEG3的表达水平降低，并可通过自噬消除分枝杆菌[4-5]。但目前关于LncRNAMEG3对脓毒症患者预后等方面的研究较少。因此，本研究旨在检测LncRNAMEG3在脓毒症患者血浆中的表达水平，分析其临床意义，以期为脓毒症患者的诊治提供实验依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选择2017年1月至2019年10月湖北省中西医结合医院重症医学科收治的脓毒症患者65例，男29例，女36例，年龄(49.8±12.3)岁。纳入标准：(1)符合2016年由美国重症医学会(SCCM)与欧洲重症医学会(ESICM)联合发布的《脓毒症3.0定义及诊断标准》[6]；(2)年龄≥18岁。排除标准：患有各类肿瘤、慢性肾脏疾病、烧伤、急性胰腺炎、72 h内有创伤或手术经历的患者。本研究共纳入一般脓毒症18例，严重脓毒症24例，脓毒症休克23例；急性生理学及慢性健康状况(APACHE Ⅱ)评分为轻度16例，中度30例，重度19例；无凝血功能障碍25例，凝血功能障碍纠正16例，凝血功能障碍未纠正24例。另选择同期于我院就诊的体检健康者65例作为健康人对照组，男31例，女34例，年龄(50.2±12.5)岁。两组研究对象性别、年龄间差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过湖北省中西医结合医院医学伦理委员会审查批准[No. 2016伦审科字第(52)号]，患者均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 CFX96实时荧光定量PCR仪、Mini-Protean3电泳分析仪、GELDOC 2000凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，Multiskan FC全自动酶联仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，Allegra X-64R高速台式冷冻离心机(美国Beckman公司)。Trizol试剂、逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3标本采集 采集各患者入院时(体检健康者于体检时采集)的空腹静脉血3 mL，4 ℃、950×g离心15 min，收集血浆，15 130×g离心15 min，去除细胞碎片，置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆转录 采用Trizol试剂提取血浆标本中的总RNA，用Multiskan FC全自动酶联仪检测RNA的浓度和纯度，取吸光度 (A260/280 nm)为1.8～2.0的标本,按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，置-20 ℃保存。

1.5实时荧光定量PCR LncRNAMEG3及内参GAPDH的引物序列根据参考文献[7]，由上海生工公司采用Primerbank引物设计软件(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)设计并合成，引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系为20 μL，包括: SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC水补足至20 μL。实时荧光定量PCR反应参数:95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 55 s；共35个循环。使用Step OneTM软件在60 ℃时采集荧光信号并进行熔解曲线分析，LncRNAMEG3的表达水平以2-ΔΔCt法计算，公式: ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)- (对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。每组设3个复孔，实验重复3次。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1各组LncRNAMEG3表达水平比较结果 LncRNAMEG3在脓毒症患者血浆中的表达水平(3.94±0.71)较健康人对照组(2.50±0.15)显著升高，差异具有统计学意义(t=16.064，P<0.05)；进一步进行亚组间比较，结果发现脓毒症休克患者LncRNAMEG3的表达水平较严重脓毒症及一般脓毒症均明显升高(P<0.05)；APACHE Ⅱ评分为重度患者较中度及轻度患者显著升高(P<0.05)；凝血功能障碍未纠正患者较凝血功能障碍纠正患者及无凝血功能障碍患者显著升高(P<0.05)。见表2。

2.2LncRNAMEG3表达水平与脓毒症患者临床病理参数的关系 LncRNAMEG3表达水平与脓毒症患者病情严重程度、APACHE Ⅱ评分以及凝血功能障碍是否纠正的差异均具有统计学意义(χ2分别为13.819、15.186和9.639，P均<0.01)；而与患者年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 各组患者血浆中LncRNA MEG3的表达水平

2.3LncRNAMEG3表达与患者预后的关系 Kaplan-Meier分析结果表明，LncRNAMEG3高表达脓毒症患者的30 d存活率为26.47%(9/34)，显著低于低表达者的70.97%(22/31)，差异有统计学意义(χ2=3.953，P<0.05)。见图1。

表3 LncRNA MEG3表达水平与脓毒症患者临床病理参数的关系

3 讨论

作为固有免疫反应的一个组成部分，LncRNA可以抑制和促进炎症信号。LncRNA在自身免疫病中可导致基因的异常表达，参与炎症性疾病的进展[8]。LncRNAMEG3具有良好的肿瘤标志物功能。然而，目前国内关于LncRNAMEG3与脓毒症患者病理因素及预后情况的关系研究少见。本研究结果表明，LncRNAMEG3在脓毒症患者血浆中的表达水平较健康人对照组显著升高，与Na等[9]研究结果相似；其研究还发现脓毒症患者血浆LncRNAMEG3高表达可增强炎性细胞因子的诱导和释放，从而导致组织的损伤和坏死，加速器官损伤、多器官功能衰竭，并能通过与miR-21相互作用，成为脓毒症发生、发展的潜在生物学标志物。此外，本研究与Chen等[3]的研究结果均提示LncRNAMEG3可作为脓毒症患者预后预测的潜在生物学标志物。

本研究回顾性分析了LncRNAMEG3表达水平与脓毒症患者临床病理参数及30 d存活率的关系，结果发现LncRNAMEG3高表达与患者病情严重程度、APACHE Ⅱ评分以及凝血功能障碍是否纠正等差异均具有统计学意义；进一步进行亚组间比较，结果发现脓毒症休克患者、APACHE Ⅱ评分为重度患者或凝血功能障碍未纠正患者血浆 LncRNAMEG3的表达水平均显著升高，提示LncRNAMEG3高表达可能与脓毒症的发生与发展密切相关。此外，LncRNAMEG3高表达脓毒症患者30 d存活率较低表达患者显著降低，提示LncRNAMEG3高表达与脓毒症患者高死亡率存在密切关系。以上结果表明，LncRNAMEG3可作为一个潜在的治疗靶点，通过下调LncRNAMEG3的表达以发挥临床治疗脓毒症的功效。

细胞凋亡是脓毒症和严重损伤(如烧伤、大手术和创伤)的常见过程，这一过程发生在损伤的早期。细胞凋亡调控是危重病患者治疗研究的一个新热点[10-11]。有学者发现，严重脓毒症和感染性休克患者细胞凋亡和坏死细胞增加[12]。Lu等[13]研究表明，LncRNAMEG3在癌症及败血症患者中分别表现为下调与上调的表达模式，但其在两者中均发挥了促进细胞凋亡的作用；LncRNAMEG3可能与p53相互作用，发挥调节癌细胞凋亡的功能。提示LncRNAMEG3可能通过类似的机制参与了脓毒症的发病，但具体的作用机制尚需进一步的实验证实。

综上所述，LncRNAMEG3与患者病情及预后关系密切，可能作为脓毒症临床治疗靶点与预后预测因子，为脓毒症的临床防治提供新思路。然而，本研究尚存在以下不足之处：(1)病例数较少，后期需扩大样本量对结论进行验证及补充；(2)缺乏相关机制作用研究，今后拟通过动物及体外实验深入探讨LncRNAMEG3在脓毒症中的作用机制。