基于微流控的RT-LAMP基因芯片工业设计方法研究

郑镇钦

摘要：新型冠状病毒SARS-CoV-2导致的新冠肺炎（COVID-19）正在全球肆虐，核酸检测是新冠病毒检测的“金标准”，快速检测SARS-CoV-2感染是评估病毒传播情况至为重要的要求。本文首先介绍逆转录环介导等温扩增反应和结果判定方法，进一步从工业设计的角度，提出基于逆转录环介导等温扩增技术RT-LAMP和微流控技术的核酸检测设计要求，提供多种新型即时检验（POCT）的设计方案，最后展望了发展的前景。

关键词：微流控;LAMP;核酸检测

一、逆转录环介导等温扩增反应（RT-LAMP）

环介导等温扩增技术英文名称为“Loop-mediated isothermal amplification”，简称LAMP。自2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开以来，广泛应用于检测食源性病原菌、沙门氏菌、金色葡萄球菌、单增李斯特菌、HIV、HPV、流感等以DNA为遗传物质的病原微生物和病毒的检测，并以灵敏度高、成本低、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器、操作简单等技术优势，被认为是最具有发展前景的核酸检测技术。

基于逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测病毒RNA的方法有潜力成为简单、可扩展和广泛适用的检测方法。对于SARS-CoV-2、流感病毒这类以RNA为遗传物质的病毒来说，需要先进行反转录之后再实施LAMP反应，也就是RT-LAMP。方法是在反应体系中加入反转录酶，反应即可进行，仍可保持很高的效率性和特异性。与现有普遍使用的基于逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）的方法相比，RT-LAMP检测是一种对设备要求更低、检测灵敏度高且快速的检测方案。

同时，LAMP具有快速、高效等优点。因为不需要预先的双链DNA的热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在1h内均可完成，添加环状引物后时间还可以节省1/2左右，在20-30min内就可检测到扩增产物，1h内可扩增出109个靶序列拷贝，且产物可以达到0.5mg/ml。对某些病毒的扩增，模板可达几个拷贝数即可，比PCR高出几个数量级，因此还具有高灵敏度。进一步的，因为是针对靶序列的6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增，因此具有高特异性。

二、LAMP核酸检测的结果判定

LAMP核酸检测的结果判定，除了传统的核酸电泳检测外，还可以通过以下方法：

一是通过浊度来判定。LAMP反应阶段，随着反应的进行，dNTP会释放出焦磷酸根离子，焦磷酸根离子遇到Mg2+会生成焦磷酸镁白色沉淀，一般情况下，生成的白色沉淀与反应液中双链DNA的量是成正比的，因此可以通过浊度仪检测白色沉淀的量来定性反应的进行程度。

二是显色反应判定。扩增结束后，其最后的产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜结构的DNA片段混合物，因此可以使用钙黄绿素或羟基萘酚蓝（HNB）来显色，通过肉眼和即时摄像AI识别来判断反应结果。

三是通过PH值来判定。LAMP反应过程中产生大量焦磷酸，pH变化明显，因此还可通过在体系中加入酚红等pH值敏感的染料来进行判断，这个方法的检测灵敏度非常高，但稳定性较差。

三、微流控RT-LAMP基因芯片的设计

微流控基因芯片是基于微流控技术的PCR反应装置，可以由PDMS或者玻璃材质制成。在检测新冠病毒SARS-CoV-2的设计中，RT-LAMP反应室可以集成多个微腔体以及相互连接的微通道，用于病毒基因的分析，具有很好的特异性，适用于病毒基因突变。而且微流控RT-LAMP基因芯片具有质硬、高度透明及化学稳定性好，可耐酸碱性，体积小巧，样本需求小，成本低，有利于摄像实时检测等特点。

微流控RT-LAMP基因芯片导热性能良好，能够保持恒定反应温度，从而显著提高扩增速度，同时，具有高度集成性，全封闭性，能够减少手工操作，有效避免样本污染。

四、工业设计的技术路径

环介导等温扩增技术（LAMP）与微流控检测技术结合的核酸扩增检测系统非常适合于应用于POCT（即时检测），技术完美结合是最具发展前景的应用方向之一。它简化了核酸扩增检测中繁琐的样品前处理和扩增产物检测步骤，检测结果可视。在工业设计中，既可以以机器视觉AI来判读，也可以人工视觉判读。

微流控RT-LAMP基因芯片的设计即恒温扩增，扩增过程无需温度变化的LAMP型，具体又分为以下方式：

一是碟式LAMP微流控基因芯片设计方案。碟式芯片沿着圆周设计8通道倍数通量的样品检测孔，每个检测孔即一个PCR管，注液体积为几微升至几十微升，检测时间小于30min。碟式芯片一般可以分为三层，上下兩层为硬度高、透明度好的玻璃材质;中间一层采用PDMS材质，并在中间层设计微流控通道和微流控腔室;三层之间用压敏胶（PSA）粘合。

二是卡式LAMP微流控基因芯片设计方案。卡式芯片可以集成泵、阀门、微通道、反应和试剂储液池，是卡片式立体工艺设计。卡式芯片为并联式分布，一般通量较小，为4至8通量。卡式LAMP微流控基因芯片采用聚苯乙烯均聚物注塑而成，可以用于杂交膜检测和核酸检测，20-30min内完成RT-LAMP检测，分析灵敏度可达每毫升100病毒颗粒。此外，卡式LAMP微流控基因芯片有利于集成AI智能判读功能和摄像分析功能。

三是PDMS-纸基混合微流控LAMP基因芯片设计方案。该方案不用对PDMS进行表面处理，而是将先进的“纸基”芯片工艺引入到LAMP装置中。该设计方案同样分为三层，底层由玻璃载片，用于支撑作用。中间为纸基芯片，设计有微流控通道和微流控腔室，顶层为是PDMS材质，设计有加样入口。

五、LAMP微流控检测技术展望

LAMP和微流控同为最具发展前景的技术方向，虽然应用场景和技术要求各不相同，但是随着微流控制作工艺的提升，并且在微阀、微泵、微反应器等功能元器件的组合下，功能将越来越丰富，应用领域逐渐宽广。基于逆转录环介导等温扩增技术RT-LAMP和微流控技术的即时检验（POCT）仪器，具有特异性强、灵敏度高、样品消耗少、节省时间、检测高效和操作简便等技术优势，相信随着技术的不断发展，在不久的将来，应该可以成为应对新冠病毒等突发、新发传染性疾病的有力工具，为守护人类生命健康起到重要的作用。

基金项目：广东省基础与应用基础研究基金项目