基于关节液代谢组学变化研究刺络药物罐疗法治疗膝骨性关节炎的机制

陈丽华　金远林　潘孝锦　周凌云

摘要 目的：基于关节液代谢组学变化分析刺络药物罐疗法治疗膝骨性关节炎（KOA）的作用机制。方法：选取2018年4月至2019年5月深圳市宝安区中医院收治的KOA患者98例作为研究对象，按照治疗方法不同分为西药观察组（n=52）和刺络药物罐疗法组（n=46）;比较所有患者治疗前后VAS评分和WOMAC评分;统计不同手段治疗前后血尿酸、C反应蛋白和红细胞沉降率;分离来自膝骨关节的关节液进行NMR分析。结果：治疗前，刺络药物罐疗法组和西药观察组VAS和WOMAC评分以及血尿酸、C反应蛋白和红细胞沉降率差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，刺络药物罐疗法组和西药观察组VVAS和WOMAC评分以及血尿酸、C反应蛋白含量和红细胞沉降率均降低，其中刺络药物罐疗法降低幅度更大，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗后，刺络药物罐疗法组和西药观察组异丁酸和葡萄糖增加，羟脯氨酸，天冬酰胺，丝氨酸和尿苷均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：刺络药物罐疗法可以有效地改善KOA患者的治疗效果和身体功能。

关键词 关节液;代谢组学;放血疗法;药物罐疗法;膝骨性关节炎;作用机制;VAS评分;WOMAC评分

Abstract Objective：To analyze the mechanism of the treatment of knee osteoarthritis （KOA） with drug canister acupuncture based on the changes of metabolomics in synovial fluid.Methods：A total of 98 patients with KOA admitted to Bao′an Traditional Chinese Medicine Hospital Group from April 2018 to May 2019 were selected as the research objects，and were divided into a control group （n=52） and an observation group （n=46）.The control group was treated with Western medicine，and the observation group was treated with drug canister acupuncture therapy.VAS scores and WOMAC scores of all patients before and after treatment were compared.Blood uric acid，C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate before and after treatment were calculated.NMR analysis was performed on the joint fluid isolated from the knee joint.Results：Before treatment，there were no statistical differences in VAS and WOMAC scores，serum uric acid，C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate between the drug canister acupuncture therapy group and the Western medicine treatment group （P>0.05）.After treatment，the VVAS and WOMAC scores，the content of serum uric acid，C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate in both groups decreased，and the treatment of drug canister acupuncture was decreased more sharply （P<0.05），which indicated that the drug canister acupuncture was more effective in treating KOA.After treatment，isobutyric acid and glucose increased，and hydroxyproline，asparagine，serine and uridine decreased in the drug canister acupuncture therapy group and the Western medicine treatment group （P<0.05）.Conclusion：By detecting metabolomics changes of joint fluid，drug canister acupuncture therapy can effectively improve the therapeutic effects and body function of patients with KOA.

Keywords Joint fluid; Metabolomics; Blood-letting therapy; Drug canister therapy; Knee osteoarthritis; Mechanism; VAS scores; WOMAC scores

中圖分类号：R242;R684文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.027

膝关节骨性关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一种常见的病因不明的慢性退行性疾病，中国老年人约占19.4%。KOA特征是关节软骨逐渐丧失，关节周围肌肉萎缩，软骨下骨增厚，骨肥大和新骨形成。KOA最常出现临床症状，包括伴有疼痛，僵硬，肌肉无力，畸形和不稳定的身体功能丧失[1]。此外，随着疾病进展，KOA损害了患者的正常生命质量，并增加了他们沉重的经济负担。代谢组学的使用为早期发现疾病提供了潜在的解决方案。关节液与膝关节组织直接接触，关节软骨的分解产物可能首先在关节液可以在血清和尿液中检测到[2]。与在血清或尿液中发现的比较，在关节液中发现的这些代谢物更加集中，这增加了可靠的早期检测关节损伤的可能性[3]。迄今为止，相关指南建议使用口服非甾体类抗炎药对KOA的治疗非常有益。然而，这些药物仅有助于轻微减少短期疼痛，并且不会改变KOA的自然病程或进展[4]。刺络药物罐疗法在精确的穴位，疼痛区域或反射区域上对患者的皮肤产生局部刺激或压力。刺络放血加药物罐疗法是用放血针或三棱针、粗毫针等刺破人体特定穴位的浅表脉络，然后将经特定中药煮制过的竹罐吸附于体表刺血处，以吸出瘀血、防病治病的方法。常用于治疗肢体关节疼痛、偏瘫等病症。迄今为止，刺络药物罐疗法已在东亚，中东或中欧和北欧等不同文化中得到广泛应用和实践[5-6]。刺络药物罐疗法已被广泛用于治疗各种慢性肌肉骨骼疾病，尤其是KOA。在这项研究中，我们基于关节液的代谢组学变化分析了刺络药物罐疗法治疗膝骨性关节炎的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年4月至2019年5月深圳市宝安区中医院收治的KOA患者98例作为研究对象，按照治疗方法不同分为西药观察组（n=52）和刺络药物罐疗法组（n=46）。刺络药物罐疗法组中男11例，女35例，平均年龄（52.16±6.38）岁。西药观察组中男9例，女43例，平均年龄（51.86±5.93）岁。2组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准

依据美国风湿病学会2001年制定的膝骨性关节炎临床诊断标准：1）年龄≥50岁。2）晨僵<30 min。3）关节活动时有骨响声。4）膝部检查示骨性肥大。5）有骨压痛。6）无明显滑膜升温。7）放射学检查有骨赘形成。膝关节疼痛患者有上述7项中的3项即可确诊。

1.3 纳入标准

美国风湿病学会诊断标准诊断为KOA的18岁以上患者[7];刺络药物罐疗法或西药治疗用作唯一的干预措施患者。医学伦理学问题：所有KOA患者均签署知情同意书，该研究获得了医院伦理审查委员会的批准（伦理批号：20180315033）。

1.4 排除标准

其他疗法（例如针灸，艾灸，按摩，中草药，中成药）与西药疗法一起用作辅助治疗的患者;精神疾病患者。

1.5 脱落与剔除标准

因各种原因不能按计划完成疗程者。

1.6 治疗方法

1.6.1 刺络拔罐组 应用放血笔组套1套（自制）;煮药锅1个;竹罐10～20个（直径约1.5～2.5 cm，长6～8 cm）;中药药包（含有五倍子、当归、川芎、苏木、鸡血藤等中药）。见图1。取穴：参照新世纪全国高等中医药院校规划教材《针灸治疗学》中痹证的取穴，选取患侧内膝眼、犊鼻、梁丘、血海、阳陵泉、阿是穴。

具体操作：患者仰卧位，以患者髌骨为中心向四周用0.5%PVP-I消毒液消毒3次;施术者双手常规消毒后，刺手持放血笔，将无菌套管端置于所取穴位上，按动笔帽端使针尖迅速向下点刺出血;从煮药锅中取出已用中药药包煮制好的竹罐，甩出附着药液，罐口轻过冷水，迅速吸拔于点刺部位，留置5 min后，取罐，用棉签擦去罐下血污，0.5%PVP-I消毒液再次消毒施术部位。1周治疗2次，4周为1疗程。见图2。

1.6.2 口服西药组 给予口服盐酸氨基葡萄糖片（江苏正大清江制药有限公司，国药准字H20060647）0.75 g/次，2次/d，连服4周。参照2010年《骨关节炎诊断及治疗指南》[8]。

对所有患者均于首次治疗前进行健康教育和运动、生活指导。参照2010年《骨关节炎诊断及治疗指南》。

1.7 观察指标

VAS和WOMAC评分：所有患者治疗前后进行视觉模拟评分法（Visual Analogue Score，VAS）[9]和西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数评分（Western Ontario and McMaster Universities西安大略大学和麦WOMAC）[10]。1）VAS：分数越高表示疼痛越严重。2）WOMAC：该问卷包括3个维度的24项（疼痛5项;僵硬2项;物理功能17项）。对于每个项目，我们有5种可能的响应选项：无，轻度，中度，严重和极端。等效分数分别为0，1，2，3和4。因此，将每个维度中的项目的分数（疼痛，僵硬，身体功能）相加以获得维度分数（疼痛0～20的分数范围，刚度0～8，身体功能0～68）。分数越高表示疼痛越严重，僵硬度越高，功能受限越大。

血尿酸、C反应蛋白、红细胞沉降率：所有患者治疗前后均需采集肱静脉血液标本，应用全自动生化分析仪（瑞士Roche公司生产，型号：Cobas c311）分别进行血尿酸（尿酸酶法）、C反应蛋白（比浊法）和红细胞沉降率（魏氏法）测定，试剂盒由深圳市雷诺华科技实业有限公司提供。

关节液代谢组学分析：所有患者治疗前后均采集患侧膝关节的关节液。分离来自膝骨关节的关节液，置于3 mL样品管中，并在液氮中快速冷冻后储存于-80 ℃，直到准备进行核磁共振波谱法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）分析。NMR分析：使样品解冻，然后取400 μL，在3 kDa离心过滤器中过滤以除去蛋白质。向每个样品中加入130 μL样品缓冲液（含有10% D2O的100 mmol/L磷酸钠缓冲液）和10 μL 1 mmol/L疊氮化钠以限制细菌生长。使用HCl和NaOH将每个样品缓冲至pH（7.00±0.04）。然后使用D2O将样品稀释至最终体积为650 μL，同时加入2，2-二甲基-2-硅杂戊烷-5-磺酸至终浓度为0.5 mmol/L。使用高分辨率一维1H NMR检查制备的滑液样品。获得的光谱最初使用来自Bruker的TopSpin软件处理，然后导入Chenomx NMR Suite 7.5，用于代谢物的定量分析。乳酸盐的浓度不包括在总和中，因为与其他代谢物浓度相比，其大的值会使标准化结果偏斜。高浓度的乳酸，厌氧和缺氧条件的特征，以前被描述为通常在发炎的膝关节和伤口愈合过程中观察到。所有零值被认为是缺失值，所有代谢物缺失超过50%将值排除在进一步分析之外。

1.8 疗效判定标准 显效：患者的临床症状已消失，且关节活动状态正常;有效：患者的临床症状明显缓解，且关节活动也已好转;无效：患者的临床症状或关节活动情况无好转，甚至症状加剧。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件對相关数据进行分析。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者VAS和WOMAC评分比较

治疗前，刺络药物罐疗法组和西药观察组VAS和WOMAC评分差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，刺络药物罐疗法组和西药观察组VAS和WOMAC评分均降低，其中刺络药物罐疗法降低幅度更大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 2组患者血尿酸、C反应蛋白和红细胞沉降率比较

治疗前，刺络药物罐疗法组和西药观察组血尿酸、C反应蛋白和红细胞沉降率差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，刺络药物罐疗法组和西药观察组血尿酸、C反应蛋白和红细胞沉降率均降低，其中刺络药物罐疗法降低幅度更大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 2组患者关节液的代谢组学比较

治疗前，刺络药物罐疗法组和西药观察组异丁酸，葡萄糖，羟脯氨酸，天冬酰胺，丝氨酸和尿苷差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，刺络药物罐疗法组和西药观察组异丁酸和葡萄糖增加，羟脯氨酸，天冬酰胺，丝氨酸和尿苷均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

刺络药物罐疗法被认为优于西药治疗。VAS是一种通用的视觉疼痛评分标准。然而，这种标准过于肤浅和简单，无法评估KOA患者疼痛经历的复杂性。因此，在我们的研究中，使用WOMAC疼痛分量表可以更加精确地检测出KOA患者疼痛相关经历变化的积极结果。将来，应该谨慎地看待应用通用仪器检测疼痛强度的研究得出的结论。此前，有研究进行系统评价，以检验刺络药物罐疗法对各种疾病的影响[11-12]。在该系统评价中，仅包括两项随机对照试验，以测试刺络药物罐疗法对KOA患者疼痛强度和身体功能的影响。其研究结果与我们的研究结果有些一致，结论是刺络药物罐疗法可能对降低疼痛强度和改善KOA患者的身体功能有益。

关于刺络药物罐疗法的作用机制，业内提出了各种理论。在现代研究中，关于刺络药物罐疗法的主要机制推测是它通过系统神经网络发挥作用并释放一些神经递质和内源性阿片类药物（一氧化氮，β内啡肽三磷酸腺苷等），导致产生欣快感，这样可以减轻伤害性疼痛的接受并使患者感到舒适[13-14]。刺络药物罐疗法可以通过头痛患者肿瘤坏死因子水平脱颗粒调节炎性反应。Barreto和Braun[15]揭示刺络药物罐疗法可通过去除氧化剂和降低自然杀伤细胞数量的细胞毒性来调节免疫系统。因此，上述基础现代科学研究可能部分地解释了刺络药物罐疗法的可能机制，并提供了对刺络药物罐疗法机制的更好理解。而刺络拔罐治疗的中医学治疗机制主要包括以下几点：1）发汗解表，通利关节，通过吸拔作用，使关节通利，发汗解表，镇痛去痹，即“风寒邪气随气出”。2）调节脏腑，阴阳平衡，拔罐对身体神经系统是一种安全无不良反应的良性刺激，加强大脑皮质对身体各部分的调节和管制功能，使局部皮肤相对应的内脏级组织代谢旺盛。3）活血化瘀，舒经通络，拔罐疗法的“吸拔”等刺激，对经络产生良性的负压效应，达到行气化瘀、疏通经络、调整脏腑的功能。4）吸毒排脓，消肿止痛，气血通畅，瘀阻消散，驱除病邪。5）扶正固本，增强身体免疫，吸拔出体内的风、寒、湿、火、毒等邪气，邪去正安。6）清热泻火，增强皮肤的渗透性，刺络拔罐的过程中，使皮肤角质层断裂，部分细胞间隔被破坏，有利病邪排出。

代谢因子在疾病发展及其进展中起重要作用。膝关节因为其特殊的结构，通过滑膜分泌的关节液进行软骨细胞代谢[16]。本文65种代谢物被定量，其中6种可被建议作为膝关节早期损伤后退行性变化的生物标志物：异丁酸，葡萄糖，羟脯氨酸，天冬酰胺，丝氨酸和尿苷值得深入分析。关节液中羟脯氨酸水平的下降指向膝骨关节中的胶原合成，因为已知羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分。与羟脯氨酸和胶原蛋白形成的翻译后修饰相关的增强的核酸代谢可通过以下方式证实：尿苷浓度降低。毫无疑问，这些生物化学过程需要额外的能量来源，这可能通过葡萄糖水平和2种生成葡萄糖的氨基酸如丝氨酸和天冬酰胺的变化来反映[17]。有趣的是，高葡萄糖浓度可能损害软骨细胞功能并促进退行性改变，这可能促进KOA的进展[18]。葡萄糖水平的增加会干扰脱氢抗坏血酸转运到软骨细胞中，从而增强活性氧的产生并促进分解代谢基因关节软骨中表达信号通路。

中医认为“阴阳失衡，百病丛生”，拔罐对身体神经系统是一种安全无不良反应的良性刺激，通过对刺激神经系统的末梢感受器和血管感受器的反射，传导到大脑神经中枢，调节大脑皮质的兴奋和抑制过程，使之趋于调和平衡。因此加强大脑皮质对身体各部分的调节和管制功能，使局部皮肤相对应的内脏级组织代谢旺盛，同时促进病灶部位组织新陈代谢增强，促进身体恢复正常，使身体康复痊愈。此外，拔罐疗法可以吸拔出体内的风、寒、湿、火、毒等邪气，邪去则正安。拔罐使皮肤出现溶血现象，可产生一种类组胺的物质，随气血运行周流全身，刺激各个脏腑器官，增强五脏六腑功能，促进新陈代谢，提高身体的免疫功能[19-20]。

总体而言，通过相关评分比较及检测关节液的代谢组学变化，说明刺络药物罐疗法可有效地改善KOA患者的疼痛症状和身体功能。

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（2019-08-18收稿 责任编辑：杨觉雄）