九里香药材及其近缘物种ITS2分子鉴定研究

邢建永　周红　吴正军　韩正洲　王瑀　姚辉

摘要 目的：应用中药材DNA条形码鉴定体系核心序列ITS2对九里香药材及其混伪品进行鉴定研究。方法：按照中药材DNA条形码分子鉴定法标准流程获取九里香药材及其混伪品ITS2序列，进行种内和种间变异分析，采用最近距离法、SNPs位点分析以及建树法，综合评估该序列的鉴定能力。结果：九里香药材及其近缘物种ITS2序列长度220～234 bp，基于K2P遗传距离不能有效区分九里香、千里香和翼叶九里香，序列分析发现九里香Murraya exotica与其他物种有3个稳定的单核苷酸多态性（SNP）位点，在UPGMA树中，不同物种的样品聚在一起，表明ITS2序列可以区分九里香药材及其近缘物种。利用中药材DNA条形码鉴定系统对44份千里香待检样品进行BLAST鉴定，结果均为正品千里香。结论：ITS2序列可用于九里香及其同属近缘物种的鉴定，为九里香药材的市场监控提供了有效手段，为其本草基因组学研究提供了依据。

关键词 九里香药材;ITS2;鉴定;芸香科;近缘种;DNA条形码;单核苷酸多态性;本草基因组学

Abstract Objective：Murrayae Folium et Cacumen and its closely related species were identified by the ITS2 sequence which was the core barcode in the DNA barcoding system for identification of Chinese medicine.Methods：ITS2 sequence of Murrayae Folium et Cacumen，medicinal material and their mixed fakes were identified according to the standard procedure of Chinese medicine DNA barcode molecular identification method，and intra-and inter-specific variation analysis was performed.The nearest distance method，SNPs locus analysis，and tree building method are used to comprehensively evaluate the identification of the sequence ability.Results：The ITS2 sequence lengths of Murrayae Folium et Cacumen and its closely related species were ranged from 220 bp to 234 bp.The results indicated that K2P genetic distance analysis cannot effectively authenticate M.exotica，M.paniculata and M.alata.Sequence analysis found Murraya exotica and other related species have 3 stable SNPs location and in the UPGMA tree，it was shown that different species can be differentiated according to their monophy，indicating that ITS2 sequence can differentiate Murrayae Folium et Cacumen and its closely related species.A total of 44 samples of Murraya paniculata to be inspected were identified based on the DNA Barcoding System showing that that the inspected samples were all authentic.Conclusion：ITS2 sequence can be used to distinguish Murrayae Folium et Cacumen from its closely related species，which provide useful ways for market monitoring of Murrayae Folium et Cacumen and benefit to its herbgenomics research.

Keywords Murrayae Folium et Cacumen; ITS2; Identification; Rutaceae; Closely related species; DNA barcode; SNP; Herbgenomics

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.009

芸香科（Rutaceae）九里香属（Murraya Koenig ex L.）由Koenig ex Linn发表于1771年[1]。目前，该属在全世界约有12种，分布于亚洲热带、亚热带及澳大利亚东北部。我国有9种及1变种，主要分布于广东、广西、海南、台湾、福建、湖南、贵州、云南等地[2]。该属植物不仅花香浓烈，持久，花色洁白美丽，树形端正，四季常青，而且浑身都是宝，被广泛地应用于日常生活中，尤其在医疗、花卉、香料及调味料等行业应用颇多[3-4]。例如，2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）[5]收载的中药材九里香Murrayae Folium et Cacumen为芸香科九里香属植物九里香Murraya exotica L.和千里香Murraya paniculata（L.）Jack的干燥叶和带叶嫩枝，具有行气止痛、活血散瘀的功效，常用于治疗胃痛、风湿痹痛、牙痛、跌扑肿痛、虫蛇咬伤等，是著名中成药“三九胃泰”的主药之一[1]。1977年版《中国药典》曾收载过，1985、1990年版《中国药典》未收载，1995年版《中国药典》[6]重新收入。又如，豆叶九里香M.euchrestifolia曾被用于治疗感冒、咳嗽、气喘和发热等[1，7];而调料九里香M.koenigii则是一种著名的咖哩粉调料，除此之外，其根及茎皮也有一定的药用价值，具有驱虫、止痛、消炎、醒脑提神等功效，可用于治疗银屑病、血液病、皮肤病及肾病等[8]。广西九里香M.kwangsiensis因枝叶中含有的丰富精油，被加工成香精[9]。

前人对九里香属植物的分类及药材基原物种进行了研究。黄成就[10]于1959年对国产九里香属植物的分类进行了总结，认为我国有6种及2变种;1978年，他又对该属植物的分类进行了修订[11]。《中国高等植物图鉴（补编）》[12]中重新收录我国本属共有8种1变种。《福建植物志》《广东植物志》《浙江植物志》中收载的九里香学名为M.exotica;而《中国树木分类学》将九里香的学名定为M.paniculata，将M.exotica视为其异名;《福建药物志》《全国中草药汇编》《中药大辞典》和《中国木本药用植物》等均将九里香学名定为M.paniculata。由于此属物种拉丁名的变更，物种名称较为混乱，可能导致其应用的混乱。且此属植物使用较为广泛，不同物种所含化学成分又不尽相同，故亟需一种准确、高效的方法对该属不同物种进行鉴定。邹联新等[13]利用扫描电镜技术对九里香属9种植物叶表面微细特征进行了比较观察，为该属的分类提供新的资料。

作为本草基因组学的重要组成部分，DNA条形码技术因其鉴定方法不受个体形态特征限制、不受个体发育阶段影响、从基因水平上客观区分物种、操作方法相对简便等特点而被广泛关注[14]。目前，中药材DNA条形码鉴定体系已被纳入《中国药典》，在药用植物基原物种[15]、药材[16]、种子[17]、超微破壁饮片[18]、中成药[19]等鉴定中已有广泛应用。罗焜等[20]证实了ITS2在芸香科植物中亦具有较高的鉴定效率。本研究基于ITS2序列对九里香属8个种99份样品进行研究，旨在考察ITS2序列对该属物种的鉴定区分能力，为其高效、准确的鉴定提供一种新方法。

1 材料

本研究涉及芸香科九里香属的8个物种共99份研究对象，其中实验样本79份，GenBank下载序列20条。实验样本包括基原植物带叶嫩枝、种子、市售药材、对照药材和复核样本。基原植物采自广西、广东、福建、海南、云南、四川、贵州、越南等地，并经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定。对照药材（以“FDC”为编号）来自中国食品药品检定研究院。复核样本（以“RC”为编号）由深圳市药品检验所、湖南省食品药品检验研究院和中国中医科学院中药研究所进行复核。样本信息见表1。

2 方法

2.1 总DNA提取、PCR扩增及测序 参照2015年版《中国药典》（四部）“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”[21]获取九里香及其近缘物种ITS2序列。

2.2 数据处理 将正反向测序结果应用CodonCode Aligner V 3.7.1（CodonCode Co.，USA）进行拼接并去除引物区，为确保DNA条形码序列的可靠性，去除测序结构两端信号弱或重叠峰区域，序列方向与PCR扩增正向产物方向一致，对上述拼接得到的DNA序列使用Koetschan等[22]建立的ITS2数据库进行注释，去除两端5.8S和28S区段获得ITS2间隔区序列。将所有序列用软件MEGA6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）分析[23]，并基于K2P模型进行遗传距离分析，用算术平均数的非加权成组配对法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA）构建系统聚类树，利用Bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率。

3 结果与分析

3.1 ITS2序列信息及分析 实验获得九里香属药用植物ITS2序列共99条，注释后序列长度为220～234 bp，平均GC含量为72.5%～75.6%。35条九里香M.exotica序列，见图1，高度保守，暂未发现变异位点。38条千里香M.paniculata序列，见图1，和14条调料九里香M.koenigii序列分别存在8个变异位点，并分别获得10种和5种不同的单倍型。2条翼叶九里香M.alata的序列完全一致，暂未发现变异位点。4条小叶九里香M.microphylla序列共存在6个变异位点，获得了2种单倍型。4条广西九里香M.kwangsiensis序列仅在190 bp处出现了C-G变异，获得2种不同单倍型。详细序列信息见表2。

3.2 种内种间遗传距离分析 实验获得九里香属药用植物ITS2序列共98条，应用MEGA 6.0软件，基于K2P遗传距离模型对各种九里香属植物的ITS2序列进行种内种间变异分析。九里香M.exotica的种内遗传距离为0，千里香M.paniculata的种内遗传距离为0.000～0.018。千里香M.paniculata和九里香M.exotica的种间最小遗传距离为0.014，千里香M.paniculata和翼叶九里香M.alata的种间最小遗传距离为0.005，它们均小于千里香M.paniculata的种内最大遗传距离0.018。

因此，基于K2P遗传距离结果不能有效区分千里香、九里香和翼叶九里香这3个物种。见表3。

3.3 SNP位点分析 SNP（Single-nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）标记是由DNA序列中单个碱基的变异引起的遗传多态性，突变频率高，是基因组分布密度最高的标记[24]。SNP包括2种形式，碱基的转换或颠换，具有分布广泛、数量巨大、遗传稳定性强的特点，基因编码区的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平等优点，而且也易于自动快速检测和自动化分析，是研究复杂遗传性状和基因组进化的理想标记。目前该技术已被应用于动植物物种鉴定和中药材鉴定中[25-28]。本研究分析比较了23条九里香属植物ITS2序列单倍型，并进行SNP位点的初步查找。发現九里香M.exotica的ITS2序列中存在3个稳定的SNP标记，即第75位的核苷酸T、第109位的核苷酸T和第173位的核苷酸A，这3个SNP位点可用于药用植物九里香M.exotica的快速分子鉴定。见图2。

3.4 UPGMA聚類树分析 基于ITS2序列单倍型构建九里香药材及其近缘物种UPGMA系统聚类树，结果显示，九里香属不同物种均显示出单系性，九里香、千里香和翼叶九里香也分别聚为不同支。因此基于UPGMA树分析，ITS2序列能够区分九里香属不同的物种。见图3。

3.5 利用中药材DNA条形码鉴定系统对千里香待检样品进行鉴定 在中药材DNA条形码鉴定系统中对44份待检千里香样品进行BLAST鉴定，结果表明44份待检千里香样品均为《中国药典》规定的正品来源，相关样品信息及鉴定结果见表4。

4 讨论

本草基因组学是利用组学技术研究中药基原物种的遗传信息及其调控网络的一门学科，本草基因组学研究产生的序列信息库能够为药材分子标记提供丰富的基因资源[29]，DNA条形码是当前国际上最受关注的分子标记。陈士林等[30]通过大量研究建立了以ITS2为核心、以psbA-trnH为辅助的中草药DNA条形码物种鉴定体系，为中药材鉴定的标准化奠定了坚实的基础，《中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则》[21]为DNA条形码技术的行业应用提供了参考。DNA条形码鉴定方法在中药材基原物种鉴定中已有广泛应用[15-18，20]，并拓展至中成药基原物种的鉴定中[19]。本研究基于DNA条形码核心序列ITS2对芸香科九里香药材及其近缘物种进行分子鉴定，结果显示ITS2序列可以鉴定九里香药材基原物种及其混伪品，基于ITS2序列对44份待检千里香样品进行鉴定，结果显示待检千里香样品均为《中国药典》规定的正品来源，为保障其安全用药提供了依据。

SNP分子标记是继以SSR、ISSR为代表的第二代分子标记技术基础之上发展起来的第三代分子标记技术[31-32]，是个体差异在DNA水平的反映，其在动植物基因组中分布广泛，信息丰富且易于检测。这种可遗传变异的特性，使得SNP分子标记技术在分子生物学和遗传学领域有广泛的应用价值。Chen等[25]已经把SNP鉴定技术应用于中药材人参、西洋参的鉴定中，并取得成功。王丽丽等[26]利用SNP快速准确鉴定了藏菖蒲。除此之外，焦文静等[27]基于SNP位点成功区分了阳春砂、海南砂和绿壳砂，赵丹等[28]基于ITS2序列SNP位点鉴定了白及药材及其混伪品。这些研究进一步说明SNP位点的解析是分析种间差异小的种群的一种重要手段。本研究中，我们通过SNP位点查找，发现有3个稳定的SNP标记存在于九里香M.exotica的ITS2序列中，其可用于药用植物九里香M.exotica的快速分子鉴定。此外，我们还分别发现九里香、千里香和翼叶九里香的ITS2序列中存在4个变异位点。但是由于翼叶九里香的样本量相对较少，这些变异位点是否可作为SNP标记用于物种鉴定还有待进一步实验验证。

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（2020-02-10收稿 责任编辑：芮莉莉）