肝细胞肝癌中TCF3表达及与预后的关系

谢 雪，石毓君，刘玉萍

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一。2015年我国新增肝癌病例达46.61万，HCC引起的肿瘤相关死亡仅次于肺癌和胃癌，位居第三[1]。因此，探寻HCC发生过程的关键分子具有重要意义。本实验分析了癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)数据库中HCC的表达谱数据[2]，发现TCF3 mRNA(也称为E2A)在肿瘤组织中高表达。作为E蛋白家族核转录因子的一员，TCF3蛋白参与大量基因的转录调控，在B淋巴细胞形成及淋巴瘤发生中发挥关键作用[3-4]；此外，TCF3还参与了结肠癌起始、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和转移，以及胰腺癌细胞增殖等方面的调控[5]。由此可见，TCF3与肿瘤的发生密切相关，但其在HCC中的研究报道较少，仅有一项体外研究有所提及[6]。因此，本实验利用TCGA数据库及华西医院收治的存档HCC标本，分析TCF3蛋白表达与临床病理特征、预后的相关性，并利用生物信息学手段分析了与TCF3 mRNA表达相关的基因及有关的信号通路，为深入研究HCC的发病机制及筛选可靠的预后标志物提供线索和依据。

1 材料与方法

1.1 数据收集、筛选和分析从TCGA官方网站的肝癌项目中(https://www.cancer.gov/)获得374个HCC患者基因表达数据，包括374例HCC癌组织样本和其中50例配对癌旁组织样本测序结果。剔除临床信息不完整的数据，最终保留240例HCC患者的完整数据进行进一步分析。

1.2 基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)采用Gsea-3.0软件进行分析，利用GSEA网站MsigDB数据库获取c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt数据集，按默认的加权富集统计方法进行富集分析，并将随机组合次数设置为1 000次。以TCF3表达作为表型标记。利用P值和标准化富集评分(normalized enrichment score, NES)对每个表型的富集途径进行排序。

1.3 TCF3抗体染色及评分收集2010年5月～2012年11月华西医院肝脏外科确诊并接受外科手术治疗的HCC组织蜡块100例，所有患者术前均未接受任何抗癌治疗，患者与家属均签署知情同意书，同时收集患者相关临床病历资料。石蜡切片行免疫组化染色，结果由两位资深病理学家根据染色强度和阳性比例对TCF3的表达结果进行评分。按阳性比例评分：阳性细胞数<5%为0分；5%～25%为1分；25%～75%为2分；>75%为3分；按染色强度评分：弱染色为1分；中等染色为2分；强染色为3分。将两项评分结果相乘作为最终评分：0～3分为低表达，4～9分为高表达。

1.4 统计学分析采用RStudio包(v.3.6.1)及SPSS 22.0软件进行统计学分析。采用Pearson相关性分析寻找与TCF3 mRNA表达相关的基因。采用Wilcoxon秩和检验和Logistic回归分析TCF3 mRNA与临床病理特征的关系。采用Cox回归和Kaplan-Meier法分析HCC临床病理特征与总生存率的关系。采用多变量Cox回归方法分析TCF3表达对生存期及其他临床特征(分期、分级等)的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库中TCF3 mRNA在HCC癌组织及癌旁组织中的表达及与临床病理特征的关系分析TCGA数据库中374例HCC癌组织和50例癌旁组织测序数据，TCF3 mRNA在HCC癌组织中的表达水平较癌旁组织上调(图1A，P<0.001)；50例配对癌及癌旁组织配对分析结果显示，癌组织中TCF3 mRNA表达水平较癌旁组织亦上调(图1B，P<0.001)。TCF3 mRNA表达与HCC分级、临床分期的相关性分析发现，随着HCC临床分期及分级的升高，TCF3 mRNA表达逐渐升高(图1C、D)。单因素分析结果提示，TCF3 mRNA高表达、临床分期、原发灶T分期及远端转移是HCC预后不良的危险因素(表1)。

表1 Cox回归分析TCGA数据库中TCF3 mRNA表达与HCC临床病理特征的关系

图1 TCF3 mRNA在肝癌及癌旁组织中的表达：A.TCF3 mRNA在癌旁组织和癌组织中的表达；B.TCF3 mRNA在配对癌及癌旁组织中的表达；C.TCF3 mRNA在不同临床分期HCC中的表达情况；D.TCF3 mRNA在不同临床分级HCC中的表达情况

2.2 HCC中TCF3 mRNA表达与患者生存分析的关系TCF3 mRNA高表达HCC患者比低表达者更容易发生肿瘤进展，预后更差(P=0.001，图2A)。单因素分析显示高表达TCF3 mRNA与不良总体生存期相关(P<0.001)，其他临床病理特征包括临床分期、原发灶T分期及远端转移(表1)。在多因素分析中，TCF3 mRNA表达(P<0.001)是HCC的独立预后因素(表1，图2B)。

图2 A.TCF3 mRNA表达对HCC患者总生存的影响；B.TCF3 mRNA表达是HCC的独立预后因素

2.3 GSEA筛选HCC中TCF3基因相关的信号通路本实验使用GESA对TCF3高表达的组织进行富集分析，以识别HCC中激活的信号通路。在TCF3 mRNA高表达肝癌组织中，细胞周期、Wnt信号通路、肿瘤相关通路、磷脂酰肌醇信号系统、VEGF信号通路及Notch信号通路均有不同程度的富集(表2，图3)。

图3 GSEA富集分析TCF3高表达HCC中激活的信号通路

表2 表型高度富集的基因集

2.4 TCF3 mRNA表达相关基因分析根据各基因的表达水平，本实验筛选出与TCF3 mRNA表达高度相关的2 937个基因(Pearson≥0.5，P<0.05)，其中TCF3与SMARCA4(又名Brg1)基因最为相关(Pearson=0.83，P<0.001)，同时还与细胞周期调控关键基因CDK4、E2F4等高度相关。对这些相关基因进行聚类分析，结果显示这些基因与RNA剪切、ATP水解酶活性、转录共激活子活性等有关(图4)。

图4 TCF3 mRNA表达相关基因的Pearson系数分析：A～C.TCF3与SMARCA4(A)、CDK4(B)及E2F4(C)基因表达的Pearson相关性分析；D.与TCF3 mRNA表达相关基因的聚类分析结果

2.5 HCC中TCF3蛋白表达及与临床病理特征及预后的关系通过免疫组化检测100例HCC中TCF3蛋白的表达水平发现，TCF3蛋白在肿瘤组织中呈高表达(图5)。根据其表达评分结果将HCC分为TCF3高表达组和低表达组，结合临床病理信息，发现TCF3蛋白高表达与肿瘤大小和TNM分期有关(P<0.05)，与性别、年龄、AFP水平及肝硬化背景等无关(表3)。同时Cox单因素和多因素分析也显示TCF3蛋白可作为HCC患者不良预后的独立预后因素(表4)。生存分析结果显示，TCF3蛋白高表达患者的无瘤生存率和总体生存率均比TCF3低表达者差(图6)。

表4 Cox回归分析肝癌患者的总生存期和临床病理特征的关系

ABC图5 肝组织中TCF3的表达,SP法:A.HCC癌旁正常组织中TCF3蛋白低表达;B.HCC肿瘤组织中TCF3蛋白低表达;C.HCC肿瘤组织中TCF3蛋白高表达

图6 TCF3表达与患者无瘤生存(A)及总体生存(B)的关系

表3 肝癌中TCF3表达与临床病理特征的关系

3 讨论

HCC作为恶性程度较高的肿瘤之一，其发生过程涉及大量基因的表达紊乱，关键转录因子，如c-myc、p53、Sirt1等介导的转录重编程在包括HCC在内的多种肿瘤的细胞恶变过程中发挥着至关重要的作用[7-10]。寻找与肝细胞恶变密切相关的转录因子，对揭示HCC发生机制及建立有效的HCC治疗手段都极为重要。本实验利用TCGA数据库及临床HCC组织标本，系统性地分析发现了与HCC预后密切相关的转录因子TCF3，其高表达提示HCC患者预后不良。TCF3作为转录因子，属于Ⅰ类bHLH家族，通过与组织特异性Ⅱ类HLH蛋白(同型二聚体或异二聚体)结合DNA来调控靶基因，在B细胞成熟过程中的作用被广泛揭示，但其在肿瘤中的作用研究较少且存在较大争议。TCF3可与EMT关键转录因子TWIST1形成复合物，促进EMT的发生及乳腺癌细胞的增殖[11-12]，而在结肠癌中TCF3低表达患者预后更差，TCF3缺失会导致结肠癌细胞增殖更快、更易转移[13]。由此可见，TCF3在肿瘤发生过程中发挥了重要作用，且在不同肿瘤中的作用截然不同。根据GSEA分析结果发现，肿瘤相关信号通路包括细胞周期、Wnt信号通路、肿瘤相关通路、磷脂酰肌醇信号系统、VEGF信号通路及Notch信号通路在TCF3高表达样本中均有不同程度的富集[14]；同时TCF3表达与细胞增殖关键基因SMARCA4、CDK4及E2F4等高度相关[15]。此外，根据HCC患者的临床资料及TCF3表达情况，本组发现TCF3高表达与肿瘤大小及TNM分期有关，是HCC患者的独立预后因素，可见即使TCF3与这些信号通路及基因的关系还未明确，但这些结果提示TCF3高表达可能促进了肝癌细胞增殖和HCC的进展，从而为控制肿瘤进展速度和增殖速度提供了治疗上的靶点。

虽然一项体外研究报道丙肝病毒核心蛋白可以通过上调TCF3蛋白表达促进肝癌细胞EMT的发生[6]，但TCF3在HCC发生过程的具体分子机制远未阐明。本实验通过系统的分析TCF3基因和蛋白水平表达与临床预后的关系，从临床角度提出了TCF3与HCC发生、进展的密切关系，同时也为我们下一步深入研究其具体分子机制提供了线索。