火焰卫矛微型快繁关键技术的建立

（北京林业大学 a.生物科学与技术学院；b.林木育种国家工程实验室，北京 100083）

卫矛Euonymus alatus，为卫矛科卫矛属落叶灌木，嫩枝绿色、无毛，老枝长有木栓质的翅，花浅红色或浅黄色，叶片春季深绿色，秋季变为血红色或火焰红色[1]，是一种具有重要观赏价值和经济价值的园艺观赏植物。在长期选育中，逐渐形成了多个栽培种，如‘KoshoMayune’、‘Timber Creek’、‘Compactus’、‘Odom’、‘Rudy Haag’和‘Pipzam’等。其中，火焰卫矛Euonymus alatuscv.‘Compacta’因其树枝密集，树形丰满而备受喜爱。仅在美国康涅狄格洲，火焰卫矛的年销售额便达到5×106美元[2]。研究火焰卫矛微型快繁技术，不仅可以提高火焰卫矛产量，还可以保持母株的优良性状。

植物离体快繁的理论基础是植物细胞全能性。自1839年细胞学家Schwann 提出其假说以来，历经120 a 持续探索深入，1958年Steward 等通过胡萝卜体细胞诱导再生完整植株[3]获得证明。随着植物组织培养技术日趋成熟，被用于单倍体育种、多倍体育种等细胞工程育种育苗科学技术研究[4,5]，亦用于产业化微型快速繁殖。杨超臣等利用香椿种子萌发的幼苗茎段为材料，构建了香椿无性组培快繁技术[6]；孙红英等以日本红枫‘青龙’的半木质化茎段为材料，构建了‘青龙’组培快繁体系[7]。观赏园艺植物火焰卫矛的组织培养亦得到关注。Chen 与祖庆学等先后以火焰卫矛子叶为材料，经遗传转化后，再生形成了新的植株[8,9]；Thammina 等通过火焰卫矛胚乳组织的离体培养，再生新的植株，培育出三倍体植株[2]。赵丽蒙以卫矛茎段为材料，经表层消毒后，诱导愈伤组织再生不定芽[10]。这些研究为火焰卫矛基因工程育种及倍性育种基础，也为推广火焰卫矛新品种并保持其优良形状、建立火焰卫矛微型快繁技术进行了探索。

植物细胞生长分化受生长调节剂、培养基类型及糖类影响[11]。不定芽与不定根的诱导受到生长素和细胞分裂素的相对浓度调节，当生长素浓度较高时有利于不定根形成，当细胞分裂素浓度较高时有利于不定芽分化[12]，且在不同物种的组织培养中，激素配比各不相同。植物微型快繁亦受到培养基类型的影响，不同培养基类型对植物组织培养具有不同效果，如相较于MS、WPM、NN 及DKW 培养基，平欧杂交榛外植体在NRM培养基上增殖分化效果更好[13]；而杜仲在MS 培养基的增殖效果明显优于在B5、White 等培养基上的增殖效果[14]。糖类在植物组织培养中亦发挥至关重要的作用，不仅参与能量供给，而且可以调节环境渗透压[15]。最新研究表明，糖类浓度还可通过调控BRI1 和BAK1 基因，进而参与G 蛋白信号传导，调控植物生长发育[16]。

本研究基于植物微型快繁进程的5 个阶段，母株的选择和养护，无菌体系的建立，不定芽扩增，不定根诱导及移栽驯化，分析火焰卫矛不定芽增殖和不定根诱导的影响因素，专门研究火焰卫矛快繁各培养阶段的最佳条件，建立火焰卫矛微型快繁技术。实验以火焰卫矛组培苗为材料，以影响植物离体培养的因素（培养基类型, 植物生长调节剂及蔗糖浓度）为研究对象，利用正交实验设计、方差数据分析等方法，探究这些因素对火焰卫矛不定芽增殖及不定根诱导的影响，优化火焰卫矛不定芽增殖和不定根诱导条件，为火焰卫矛微型繁殖生产提供理论基础和技术参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

红叶卫矛Euonymus alatuscv.‘Compacta’组培苗由美国康涅狄格大学李义教授馈赠，取材于美国康涅狄格洲黎巴嫩镇PridesCorner 农场。取继代增殖培养1 a 后的健壮组培苗，用于以下各项实验。

1.2 培养条件对不定芽增殖的影响

对影响红叶卫矛不定芽增殖的因素（培养基类型、6-BA 浓度、IBA 浓度及蔗糖浓度），进行4 因素4 水平正交实验设计，共16 个处理（表1），并据此配制增殖培养基。所有增殖培养基的pH 值为5.8，琼脂浓度为6 g·L-1。选取生长健壮的红叶卫矛组培苗，分别接种于16 种增殖培养基上，并置于组织培养间内培养。培养条件为温度（24±1）℃，光照强度3 000 lx，光周期16 h/8 h（光/暗）。5 周后，统计测量腋芽萌发数、腋芽生长量、顶芽生长量，计算增殖系数=腋芽萌发数/接种外植体数，平均生长量=（腋芽生长量+顶芽生长量）/接种外植体数。正交实验设计共16个处理，每个处理设3 个重复，每个重复接种30 株，共计1 440 株。

1.3 培养条件对生根的影响

1.3.1 生根阶段Ⅰ的激素配比、蔗糖浓度及处理时间对不定根诱导的影响

本研究以二步法诱导组培苗生根。在生根阶段Ⅰ中，对影响不定根诱导的培养条件（IBA 浓度、NAA 浓度、蔗糖浓度、处理时间）进行了四因素四水平正交试验设计（表2）。以1/2 WPM为基本培养基，根据表2配制生根培养基Ⅰ。选取生长健壮的火焰卫矛组培苗，分别接种于16 种生根培养基Ⅰ上，并置于组织培养间内培养。正交实验设计共16 个处理，每个处理设3 个重复，每个重复接种30 株，共计1 440 株。经生根培养基Ⅰ诱导后，将组培苗转移到生根培养基Ⅱ（1/2 WPM+蔗糖20 g·L-1+活性炭2.0 g·L-1）上培养4周，统计生根率=生根外植体数/接种外植体数*100%；平均生根数=不定根总数/接种外植体数；平均根长=不定根总长度/不定根总数。

1.3.2 生根阶段Ⅰ的培养基类型与培养基强度对不定根诱导的影响

为进一步优化生根培养基Ⅰ，在最佳激素配比及蔗糖浓度的基础上，继续探究了培养基类型及培养基强度对生根情况的影响。将生长健壮的组培苗分别接种于DKW 培养基和WPM 培养基不同强度（1/2、1/3、1/4）的生根培养基Ⅰ上。每个处理设3 个重复，每个重复30 个样品，共计540 株。在生根培养基Ⅱ（1/2 WPM+蔗糖20 g·L-1+活性炭2.0 g·L-1）上培养4 周后，统计生根情况。

1.3.3 生根阶段Ⅱ的蔗糖浓度对生根的影响

在最佳生根培养基Ⅰ的基础上，研究了生根阶段Ⅱ的蔗糖浓度对生根的影响。将在生根培养基Ⅰ培养后的火焰卫矛组培苗转接至含不同浓度蔗糖和活性炭2.0 g·L-1的1/4 WPM 培养基上，组培间内培养4 周后，统计生根情况。

1.4 生根组培苗的芽休眠解除与移栽、炼苗

生根后的火焰卫矛组培苗普遍存在芽休眠现象。为解除生根组培苗芽休眠，提高组培苗移栽成活率，将生根后的组培苗转移至冰箱中，4 ℃黑暗处理3 个月[2]，而后转移至组培间内培养两周。将生根组培苗置于散射光的炼苗间（25±1℃），并于一周内逐渐打开培养瓶盖，使组培苗逐渐适应空气湿度变化。分别取30 株健壮组培苗移栽至珍珠岩∶草炭土=1∶1 和仅含珍珠岩的花盆中，并设3 个重复，培养于温室内。移栽第一周，在花盆上覆盖塑料薄膜，每天浇水一次；第二周逐渐将塑料薄膜掀开，改为每两天浇水一次。50 d 后，统计移栽苗成活率。待移栽苗长出新叶后，将植株栽种于田间。

1.5 数据分析

采用SPSS 的ANOVA 法，以培养基类型、6-BA浓度、IBA 浓度及蔗糖浓度为固定因子，以不定芽增殖或不定根诱导的相关统计结果为因变量，进行单变量方差分析，确定各因素在不同阶段是否具有显著影响；并对具有显著影响的培养条件进行均值比较，确定最佳的火焰卫矛培养条件。

2 结果与分析

2.1 培养基成分对不定芽增殖的影响

火焰卫矛茎段接种于16 种增殖培养基上，培养5 周后，观察茎段生长情况。发现火焰卫矛茎段在MS、WPM 及DKW 培养基均能大量诱导不定芽形成，其中在DKW 培养基上生长状况最好，叶色嫩绿，茎段直立；但在B5 培养基上生长很差，接种的茎段生长缓慢，只有极少的茎段在五周后分化出不定芽，说明B5 培养基不适用于火焰卫矛的茎段培养。接种在含不同蔗糖浓度培养基上，火焰卫矛茎段生长长度随蔗糖浓度增加而增长。但当蔗糖浓度超过30 g·L-1后，叶片出现变红的现象，生长量降低。统计腋芽萌发数、腋芽生长量、顶芽生长量，计算增殖系数及平均生长量。不同处理下，增值系数最小值为1.14，最大值为3.73；平均生长量最小值为0.08 cm，最大值为2.03 cm（表1）。经SPSS 方差分析，培养基类型与6-BA 浓度对增殖系数影响极显著（P＜0.01），而IBA 浓度与蔗糖浓度对其影响不显著；培养基类型、6-BA 浓度与蔗糖浓度对平均生长量具有极显著影响（P＜0.01），IBA 浓度影响不显著。对显著影响因素进行均值比较，发现6-BA 浓度为4.0 mg·L-1，培养基类型为WPM 或DKW 时，增殖系数最大；培养基类型为DKW、6-BA 浓度为0.5 mg·L-1、蔗糖浓度为30 g·L-1时，平均生长量最大。综合考虑各因素对增殖系数和平均生长量的影响，确定火焰卫矛茎段增殖的最佳条件为DKW+6-BA 4.0 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1。本研究中与最佳条件相似的处理为处理13，繁殖系数为3.73，平均生长量为1.07 cm，且萌发的腋芽叶色嫩绿，生长旺盛（图1）。

2.2 影响不定芽生根的最佳条件

火焰卫矛不定芽经过不同生根培养基Ⅰ的根原基诱导后，在生根培养基Ⅱ上培养4 周，观察不定芽的生根情况，发现处理2 的生根数最多，且根系粗壮（图2A）。在阶段Ⅰ不同浓度的蔗糖、IBA、NAA 及处理时间下，不定芽生根率、平均生根数及平均根长均存在较大变化幅度（表2）。经SPSS 方差分析，蔗糖对生根率影响极显著（P＜0.01），其他因素对其影响不显著；蔗糖对平均生根数具有极显著影响（P＜0.01），IBA 浓度对其具有显著影响（P＜0.05）；IBA 对平均根长有极显著影响（P＜0.01），诱导时间对其有显著影响（P＜0.05）。经均值比较，蔗糖浓度为0 时生根率最高；蔗糖浓度为0，IBA 浓度为0.5 或2.0 mg·L-1时生根数最多；IBA 浓度为2.0 mg·L-1，处理时间为21 d 时，平均根长最大。生长素浓度及处理时间不宜过高，当NAA 或IBA浓度为2.0 mg·L-1，处理时间为28 d 时，火焰卫矛组培苗生长状况差，并出现叶色变红（图2B）。

表1 培养基不同成分对火焰卫矛茎段增殖的影响†Table 1 Effect of different components of culture medium on stem proliferation of Euonymus alatus

图1 火焰卫矛的不定芽扩繁Fig.1 The propagation of adventitious bud in Euonymus alatus cv.‘Compacta’

生根阶段Ⅰ培养基类型及培养基强度对生根影响的数据统计分析结果表明（表3），两者对生根率均没有显著影响；培养基类型对平均生根数和平均根长具有显著影响（P＜0.05）。均值比较发现，WPM 更适于火焰卫矛生根培养。

综上所述，火焰卫矛不定根诱导的最佳生根培养基Ⅰ为1/4 WPM+IBA 2.0 mg·L-1，处理时间为21 d。此时的生根率为96.7 %。

通过统计不定芽在不同蔗糖浓度生根培养基Ⅱ中的生根情况，发现随着蔗糖浓度的增加，平均生根数及平均根长先增加后减少，当蔗糖浓度为10 g·L-1时，平均生根数及平均根长最大，平均生根数为2.73 个，平均根长为3.41 cm（表4）。经SPSS 分析，蔗糖浓度对生根数具有极显著影响（P＜0.01），对平均根长具有显著影响（P＜0.05），对生根率没有显著影响。

图2 火焰卫矛的不定根诱导Fig.2 The induction of adventitious root in Euonymus alatus cv.‘Compacta’

表2 生根阶段Ⅰ蔗糖、NAA、IBA 及时间对生根的影响Table 2 Effect of sucrose, NAA, IBA and treating time on rooting at stage Ⅰ

表3 生根阶段Ⅰ培养基类型及培养基强度对生根的影响Table 3 Effect of medium type and medium strength on rooting at stage Ⅰ

表4 生根阶段Ⅱ蔗糖对生根的影响Table 4 Effect of sucrose on rooting at stage Ⅱ

2.3 生根小植株顶芽休眠解除与移栽驯化

火焰卫矛不定芽生根形成的小植株有顶芽休眠现象，将其置于4 ℃条件下处理3 个月后，93.33%的小植株解除休眠，顶芽迅速伸长（图3A～B）。芽休眠解除的火焰卫矛组培苗，经过移栽、炼苗后，统计移栽成活率。以珍珠岩为移栽基质，成活率为98.89±1.92%；以珍珠岩∶草炭土=1∶1 为移栽基质，成活率为84.44±5.09%。火焰卫矛组培苗移栽成活的关键在于控制空气湿度与土壤透气性，以避免地上部分干枯、地下部分腐烂。因此，在火焰卫矛组培苗移栽过程中，宜选择珍珠岩作为移栽基质，提供基质透气性，并在炼苗初期以塑料膜覆盖，保持空气湿度。待移栽苗长出新叶后，栽种于北京田间，长势健壮（图3E）。田间的火焰卫矛植株在秋季叶色变红，可安全越冬（图3F）。

图3 火焰卫矛生根组培苗的芽休眠解除、驯化、移栽Fig.3 The bud dormancy release, acclimatization and transplantation in Euonymus alatus cv.‘Compacta’

3 讨 论

迄今为止，国际公开发表的培养基已达数百种，而目前用于火焰卫矛的培养基主要为MS 及WPM 两种，且尚无研究表明哪种培养基更为适宜。本研究分析了4 种不同培养基对火焰卫矛增殖系数的影响，发现相较于MS 培养基和B5 培养基，WPM 培养基及DKW 培养基更适宜火焰卫矛不定芽增殖。杨秀平等对常用的14 种植物培养基进行了成分数据分析，并聚类分成四类：高无机盐培养基、高硝酸钾培养基、中等无机盐培养基及低无机盐培养基[17]。适用于火焰卫矛组织培养的WPM 培养基和DKW 培养基同属于低无机盐培养基，而MS 培养基和B5 培养基则分属于高无机盐培养基和高硝酸钾培养基。这说明火焰卫矛更适宜培养于低无机盐培养基上，培养基为植物的生长提供营养和环境条件，不同物种所需营养组成、渗透水势等不同。过高的无机盐浓度，将导致细胞脱水，影响细胞的正常分裂分化；而过低的无机盐浓度无法满足细胞生长分化所需的物质，亦会导致组织生长分化缓慢。这也为火焰卫矛近缘种的培养基选择提供参考。

蔗糖的最佳浓度在火焰卫矛组织培养不同阶段存在很大差异。在不定芽增殖过程中，蔗糖的最佳浓度为30 g·L-1；在生根Ⅰ阶段，蔗糖最佳浓度为0；生根Ⅱ阶段时，蔗糖浓度为10 g·L-1。由于离体培养的外植体很难通过光合作用完成自养，培养基中的糖类便成为外植体的重要能量来源[18]。因此在不定芽培养过程中，添加较高浓度的蔗糖，可为不定芽生长分化提供所需能量，促进不定芽增殖；但当蔗糖浓度过高时，培养基渗透压太大，将抑制不定芽生长。在不定根诱导过程中，蔗糖亦为外植体的生根诱导提供所需能量。在洋兰一步法诱导不定根过程中，较高浓度的蔗糖可发挥积极作用，促进根系诱导发育[19]。但在火焰卫矛二步法诱导不定根过程中，生根阶段Ⅰ不添加蔗糖更有利于不定根诱导。这与铁核桃组培苗二步法生根相似，即第一步在含IBA 的1/4 DKW 培养基中诱导根原基形成，第二步在含活性炭和蔗糖20 g·L-1的1/4 DKW 培养基中促进根原基生长[20]。综上所述，培养基中的蔗糖浓度可调节不定芽增殖与不定根诱导的进程，且在不同物种的不同阶段蔗糖用量并不相同。因此，在植物微型快繁体系的建立中，应当将蔗糖浓度作为一项重要的影响因素，予以优化。

在火焰卫矛组培苗微型快繁过程中，组培苗的不定根诱导通常会导致芽休眠的发生。芽休眠现象在水仙、百合的不定芽增殖及牡丹的不定根诱导中亦有发生[21-23]。芽休眠作为落叶植物的一种保护机制，对于植物度过不利环境具有重要作用。但在植物组织培养中，芽休眠延缓生长分化和移栽驯化进程。虽然通过低温处理解除芽休眠可使绝大多数休眠芽恢复生长，但需消耗大量时间、处理设备和空间，制约了组培苗微型快繁的速度。本实验室采用低温与赤霉素联合处理的方法，将芽休眠组培苗接种于含GA332 mg·L-1的生根培养基Ⅱ上，置于4 ℃冰箱内低温处理，45 d后芽休眠解除率可达83.3%（数据未发表）。此方法的芽休眠解除率虽低于低温处理的93.33%，但所需时间仅为前者的一半，具有一定的生产价值。若希望进一步消除芽休眠对植物微型快繁的消极影响，今后的研究需阐明芽休眠产生及解除的具体分子机制，获得调控芽休眠发生与解除的关键基因，并利用转基因技术抑制芽休眠相关基因表达或促进芽休眠解除相关基因持续表达，获得无芽休眠的微型快繁新品种。

研究培养基成分对火焰卫矛不定芽增殖及不定根诱导的影响，可以为火焰卫矛的工厂化大规模生产提供理论依据与技术支持。但组培苗工厂化的最大制约因素是生产成本，而生产成本主要由培养基成本、培养基配制成本、接种及培养成本、洗涤成本、移栽成本、仪器设备折旧费、房屋使用费等成本组成。本研究所使用的培养基为商业化混合培养基，培养基成本高；同时固体培养基配制、组培苗的接种及培养成本也比较高，这些因素均需进一步优化。如果以特定的天然营养源（如马铃薯、大豆等）等为基础，加入适当成分如生长调节剂构成适合火焰卫矛微型快繁的半合成培养基，并形成在液体培养基（组织培养连续系统）中扩繁生根，可降低成本进行工厂化生产。

4 结 论

本研究以火焰卫矛组培苗为材料，探究了培养基不同成分对火焰卫矛不定芽增殖及不定根诱导的影响，并发现火焰卫矛不定芽增殖的最佳培养 基 为DKW+6-BA 4.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，繁殖系数为3.73；最佳生根培养基Ⅰ为1/4 WPM+IBA 2.0 mg·L-1；最佳生根培养基Ⅱ为1/4 WPM+蔗糖10 g·L-1+活性炭2.0 g·L-1，生根率可达98.89%。研究结果为火焰卫矛相关研究提供组织培养技术基础，为提升良种苗木生产提供技术保障。