丁香油对蟹黄鲜虾酱贮藏品质的影响*

陈小雷 胡 王 马朝彬 凌 俊 段国庆 鲍 凯

(1. 安徽省农业科学院水产研究所 水产增养殖安徽省重点实验室 合肥 230031；2. 安徽省农业科学院 合肥 230031；3. 阜阳市老庙镇农村综合服务站 阜阳 236143；4. 安徽惠民实业有限责任公司 芜湖 238331)

蟹黄鲜虾酱是将巢湖秀丽白虾(Exopalaemon modestus)、河蟹(Eriocheir sinensis)蟹黄煸炒后添加到黄豆酱中，经炒制、调味、冷却、包装、高温杀菌后制成的佐餐调味酱。蟹黄鲜虾酱油脂含量高，富含高蛋白、高不饱和脂肪酸蟹黄、鲜虾的添加使其在贮藏过程中更易出现脂肪酸败和蛋白质氧化变质，进而影响蟹黄鲜虾酱的组织、风味等特性，且氧化产物会引起人体动脉粥样硬化、胃肠病以及癌症等(Negre-Salvayre et al, 2010)。

丁香既是GB2760-2014 中允许使用的食用香料，又是植物源食品保鲜剂和抗氧化剂，除赋予食品独特的风味外(Suhaj, 2006)，还能降低食品的过氧化物值(沈勇根等, 2012)，抑制汉母逊氏酵母菌(Torujopsis)、青霉(Penicillium)、黑曲霉(Rhizopus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)的生长(吴传茂等, 2000)，丁香油和桂皮油复合使用能延缓冷却猪肉的腐败变质(姚成强等, 2011)，丁香醇提取物可以延长新鲜羊肉保质期至4 d (Kumudavally et al, 2011)。在实际使用过程中，丁香油少量添加达不到抗氧化效果，大量使用则会影响产品的风味。基于此，本研究着重考察丁香油作为香料和抗氧化剂对蟹黄鲜虾酱贮藏过程中风味、脂肪酸组成及含量、蛋白质和脂肪氧化的影响，以探索蟹黄鲜虾酱贮藏过程中，脂肪氧化与脂肪酸组成及含量的关系，并为丁香油在酱制品的工业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

蟹黄鲜虾酱采自安徽省惠民实业有限责任公司，采购时间为2018 年6 月；丁香油为丁香全提取物，总酚含量约80%，购自陕西浩洋生物科技有限公司，采购时间为2018 年6 月。

高氯酸、尿素、十二烷基磺酸钠、乙二胺四乙酸、Tris-HCl 等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；IMP(5′-肌苷酸)标准品、GMP(5′-鸟苷酸)标准品、AMP(5′-腺苷酸)标准品，购自上海安谱实验科技股份有限公司；MDA 试剂盒和BCA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验仪器

FA25 型高速分散机，弗鲁克(上海)公司；CR22G型高速冷冻离心机，日本日立公司；TU-1901 紫外–可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；GC-2010 Plus气相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理 按照安徽省惠民实业有限公司生产蟹黄鲜虾酱常规方法制好后，平均分成2 组：1 组按酱质量添加0.2%丁香油，混匀，分装后121℃高温灭菌30 min，为实验组；另1 组分装后121℃高温灭菌30 min，为对照组。2 组样品于25℃恒温贮藏，每45 d 取样进行检测，每组6 个平行。

1.3.2 游离氨基酸的测定 参考Wang 等(2016)的方法并稍作修改。将酱制品混匀，取适量均质后加入15 ml 5%三氯乙酸溶液，冰浴匀浆2 min，超声5 min后静置2 h，4℃ 15000 r/min 离心10 min。取5 ml上清液，用1 mol/L NaOH 溶液调节pH 至(2.00±0.05)后，蒸馏水定容至10 ml。取适量溶液过0.45 μm 的水相针式超滤膜后待检测。将待测液放入自动氨基酸分析仪中，在570 和440 nm (Pro)下进行检测。

1.3.3 脂肪酸的测定 按照GB 5009.168-2016 方法测定。

1.3.4 呈味核苷酸的测定 参照Kong 等(2012)的方法并稍作修改。称(5.00±0.01) g 样品均质后加入30 ml 4℃预冷的5% HClO4溶液，冰浴匀浆2 min 后超声5 min，然后4℃ 15000 r/min 冷冻，离心10 min取上清液，向沉淀加入10 ml 4℃预冷的5% HClO4溶液，重复上述步骤至离心结束，合并2 次上清液，用提前配好的KOH 和HClO4溶液调节pH 至5.75，之后将上清液定容至50 ml，取适量用0.22 μm 微量过滤膜过滤至进样瓶，待测。

高效液相色谱条件如下：色谱柱：岛津Intersil ODS-3(205.0 mm×4.6 mm)；柱温为30℃；流动相：甲醇(A)和 pH 为 5.75 的磷酸缓冲液(B)；流速：1 ml/min；洗脱程序见表1，洗脱时间为30 min；PDA检测器全波段扫描，选取248 nm 进行数据处理。

1.3.5 味道强度值(TAV)及味精当量(EUC) 参照王丹青等(2018)，滋味物质的味道强度值(Taste activity value)的计算公式如下：

式中，C 为滋味物质的绝对浓度值，T 为该滋味物质的阈值。

味道当量(Equivalent umami concentration)的计算公式如下：

式中，EUC 单位为g MSG/100 g；1218 为协同作用常数；ai 为鲜味氨基酸的浓度(g/100 g)；bi 为鲜味氨基酸相对于MSG 的鲜度系数(天门冬氨酸Asp为0.077, 谷氨酸Glu 为1)；aj 为呈味氨基酸的浓度(g/100 g)；bj 为呈味氨基酸相对于IMP 的鲜度系数(IMP 为1, GMP 为2.3, AMP 为0.18)。

1.3.6 总巯基含量的测定 (1)肌原纤维蛋白的提取：参照Yang 等(2015)的方法。取10 g 样品，加入20 ml、4℃预冷的去离子水，12000 r/min 匀浆30 s，10000 r/min、4℃离心20 min，弃上清液，向沉淀加入去离子水，重复提取1 次。沉淀中再加入20 ml、4℃预冷的0.05 mol/L 磷酸缓冲液(pH 为7.2)(其中补充0.6 mol/L NaCl)，12000 r/min 匀浆30 s，10000 r/min、4℃离心20 min，收集上清液。沉淀用上述含有NaCl的磷酸缓冲液重复提取1 次，合并上清液。蛋白质含量采用BCA 试剂盒测定。

(2)总巯基含量的测定：参考Benjakul 等(2009)的方法。调节(1)中提取的肌原纤维蛋白溶液浓度至4 mg/ml，取0.5 ml，加入4.5 ml 0.2 mol/L Tris-HCl Buffer [pH 为6.8，含有8 mol/L 尿素、2%十二烷基磺酸钠(SDS)、10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)]。取1 ml 上述混合液，加入0.1 ml 0.1% DTNB，40℃温育25 min，测定其OD412nm。空白对照以0.6 mol/L KCl溶液(pH 为7.0)代替样品。总巯基含量的计算公式如下：

总巯基含量(nmol/mg) = [(D×n)/(ε ρ)]×106(3)

式中，D 为412 nm 波长处的吸光度；n 为稀释倍数；ε 为摩尔吸光系数，取值为13600 L/(mol·cm)；ρ 为蛋白质质量浓度(mg/ml)。1.3.7 丙二醛含量的测定 称取定量蟹黄鲜虾酱，加入5 倍体积去离子水，10000 r/min 匀浆1 min，进行丙二醛含量的检测。依据硫代巴比妥酸法原理采用试剂盒检测，结果以 1 mg 样品中丙二醛的含量(nmol/mg)表示。

1.3.8 数据统计分析 实验结果采用平均值±标准差(Mean±SD, n=6)表示。采用SPSS 17.0 对数据进行统计分析和多重方差分析，所有显著性均在P≤0.05水平下检验。

2 结果与分析

2.1 蟹黄鲜虾酱贮藏过程中丙二醛含量的变化

丙二醛常用来衡量脂质氧化程度，其含量越高，肉制品氧化程度就越高，品质也越差(Pignoli et al,2009)。作为脂肪氧化二级产物，丙二醛还可以与蛋白的多肽骨架及其边链发生氧化修饰，改变蛋白质的构象(Zhao et al, 2012)。

蟹黄鲜虾酱在25℃贮藏过程中丙二醛的变化情况见图1。从图1 可以看出，对照组和实验组丙二醛含量均显著升高。0 d 时，对照组和实验组差异不显著；45 d 后，对照组显著高于实验组，说明0.2%的丁香油对蟹黄鲜虾酱贮藏过程中脂肪氧化有抑制作用，这与江慎华等(2010)、沈勇根等(2012)、Karuppiah 等(2012)的研究结果一致，因为丁香油的主要物质丁香酚(沈勇根等, 2012)具有疏水性，疏水性氨基酸可以捕获脂类自由基，加强抗氧化肽与疏水性多不饱和脂肪酸的相互作用，从而延缓脂质氧化反应(Burt, 2004)。

图1 蟹黄鲜虾酱贮藏过程丙二醛含量变化Fig.1 The changes of MDA content during storage of crab cream and shrimp sauce

2.2 蟹黄鲜虾酱贮藏过程中总巯基含量的变化

肉品中蛋白质的巯基含量很丰富，且易发生氧化反应(陆玉芹等, 2015)，在加工、运输、贮藏过程中，肌原纤维蛋白空间结构发生改变，使埋藏在分子内部的疏基活性基团暴露出来被氧化成二硫键，导致疏基含量减少(Dean et al, 1997)，因而常用巯基含量的变化指示蛋白质氧化的程度(屠冰心等, 2014)。蛋白质氧化会降低肉制品品质、功能及消费者的可接受性。

蟹黄鲜虾酱在25℃贮藏过程中总巯基含量的变化如图2 所示。随着贮藏时间的延长，对照组和实验组总巯基含量呈下降趋势，贮藏90 d 以上，总巯基含量均显著降低，因为经过加热和高温灭菌处理，蟹黄鲜虾酱中蛋白质空间结构发生改变，且受到各种促氧化成分如自由基等的攻击，蛋白质发生氧化，巯基含量下降(Xia et al, 2009)。贮藏90 d 后，实验组总巯基含量显著高于对照组，说明丁香油对蟹黄鲜虾酱贮藏过程蛋白质氧化有抑制作用，与Karuppiah 等(2012)和姚洁玉等(2019)的研究结果类似，因为脂质氧化生成的活性和非活性自由基夺取蛋白的氢原子，生成蛋白自由基，引发蛋白质链式反应，从而促进蛋白质氧化(Stadtman et al, 2003)，而丁香油抑制脂肪氧化，也会对蛋白质氧化起到一定的抑制作用。

图2 蟹黄鲜虾酱贮藏过程总巯基含量的变化Fig.2 The changes of T-SH content during storage of crab cream and shrimp sauce

2.3 蟹黄鲜虾酱贮藏过程中脂肪酸组成及含量的变化

肉类的营养和品质与肌肉脂肪的含量和组成密切相关(Utaiwan et al, 2007)。脂肪酸的分解不仅导致食品风味的劣变，氧化产物还会与蛋白质发生反应，进一步促进蛋白质的氧化(Stadtman et al, 2003)。

对照组蟹黄鲜虾酱在25℃贮藏过程中，脂肪酸组成及含量变化如表2 所示。新鲜蟹黄鲜虾酱中共检出 29 种脂肪酸，随着贮藏时间的延长，脂肪酸种类不断减少，180 d 后，仅检出19 种。饱和脂肪酸总量从55.869%增至80.439%，单不饱和脂肪酸总量从19.141%降至 4.906%，多不饱和脂肪酸总量从24.991%降至14.655%；其中，C8 :0、C12 :0、C13 :0、C14 :1、C15 :0、C15:1、C16 :0、C17 :1、C18 :1n9t、C18 :2n6t、C20:1、C20 :3n6、C20:3n3、C20:4n6 和C22 :1n9 显著降低，C16 :1、C17 :0、C18 :0、C18:2n6c、C20 :0、C18:3n3、C21 :0、C20 :2、C22 :0、C23 :0、C22:2n6和C20 :5n3 显著升高。这种变化是因为蟹黄鲜虾酱经过加热和高温灭菌处理，加之贮藏过程中温度、自由基等因素的影响，脂肪酸体系受到破坏，不饱和脂肪酸优先发生氧化降解(Yagiz et al, 2009)；同时，脂肪氧化过程中，自由基连锁攻击不饱和脂肪酸，使其趋于饱和，一部分不饱和脂肪酸转变成饱和脂肪酸，一部分变成单不饱和脂肪酸(刘冬敏等, 2013)；一些长链不饱和脂肪酸多位于磷脂中，会发生碳链延长和去饱和现象(Memon et al, 2011)。

表1 高效液相法核苷酸梯度洗脱程序Tab.1 HPLC gradient elution program for nucleotide analysis

表2 对照组蟹黄鲜虾酱贮藏过程脂肪酸组成及含量变化(g/100 g)Tab.2 The changes of fatty acids and their contents during storage of control crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

实验组蟹黄鲜虾酱25℃贮藏过程中，脂肪酸组成及含量变化如表3 所示。随着贮藏时间的延长，饱和脂肪酸含量由55.786%升至69.814%，单不饱和脂肪酸由18.847%降至10.233%，多不饱和脂肪酸由25.367%降至19.953%；其中，C8 :0、C12 :0、C13 :0、C14 :0、C14 :1、C15 :0、C15 :1、C16 :0、C17:1、C18 :1n9t、C18 :1n9c、C18 :2n6t、C20 :1、C20:3n6、C20 :3n3、C20 :4n6 和C22:1n9 显著降低，C16 :1、C17:0、C18 :0、C18 :2n6c、C20 :0、C18:3n3、C21 :0、C20 :2、C22 :0、C23 :0、C22 :2n6 和C20 :5n3 显著升高，而C13 :0、C14 :0、C14:1、C15 :0、C15 :1、C16:0、C17 :0、C17 :1、C18 :1n9t、C20:1、C20 :3n6、C20:3n3、C20 :4n6 和C22:1n9 的变化趋势与对照组有所不同。贮藏180 d后，实验组饱和脂肪酸含量比对照组降低13.2%，单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量分别提高1.1 倍和36.2%。由此可见，丁香油对蟹黄鲜虾酱不饱和脂肪酸具有保护作用，因为丁香油的主要成分丁香酚能够清除顽固2,2-二苯基-1-苦基肼自由基，降低过渡金属离子的浓度，从而有效延缓不饱和脂肪酸反应生成烷氧基、过氧化氢的反应和脂质过氧化启动物铁氧系螯合物的产生(罗雨婷等, 2017)。

表3 实验组蟹黄鲜虾酱贮藏过程脂肪酸组成及含量变化(g/100 g)Tab.3 The changes of fatty acids and their contents during storage of test crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

2.4 蟹黄鲜虾酱贮藏过程中呈味核苷酸及游离氨基酸组成的变化

核苷酸是一种重要的呈味物质，GMP 和IMP 鲜味最强，除了增鲜，核苷酸对甜味有增效作用，对咸味、苦味、酸味和焦味等有消杀作用(Fuke et al,1996)：IMP 增强食物的咸感，具有减盐作用；GMP增强食物的入口爽滑感，能改善食物在口中滞留的感觉；AMP 在较低浓度(<50～100 mg/100 g)下呈甜味，当浓度>100 mg/100 g 时，甜味逐渐减弱，鲜味逐渐增强(Rotzoll et al, 2006)；低浓度的IMP 能够增强AMP 的鲜味和甜味。对照组蟹黄鲜虾酱在25℃贮藏过程中呈味氨基酸含量变化如表4 所示，含量最高的是GMP，其次是IMP。随着贮藏时间的延长，3 种呈味核苷酸波动降低，因为在有水体系中，呈味核苷酸的稳定性随蟹黄鲜虾酱pH、含水量、温度和酸碱度的变化而变化(崔桂友, 1999)。

表4 对照组蟹黄鲜虾酱贮藏过程中呈味核苷酸及游离氨基酸组成的变化(g/100 g)Tab.4 The changes of taste nucleotides and free amino acids during storage of control crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

游离氨基酸的种类和含量与蟹黄鲜虾酱的口感、风味、营养和生理活性有关(Namanug et al, 2010)。对照组蟹黄鲜虾酱在25℃贮藏过程中游离氨基酸含量变化如表4 所示。检出的16 种游离氨基酸贮藏180 d均显著提高，因为随着蟹黄鲜虾酱贮藏时间的延长，蛋白质不断发生降解，导致游离氨基酸含量增加。呈鲜味氨基酸中，含量最高的为谷氨酸，与IMP 有显著的协同增效作用，是蟹黄鲜虾酱鲜味的主要贡献者；呈甜味氨基酸中，丙氨酸含量最高，与谷氨酸、肌苷酸等呈味物质有协同作用，还具有协助葡萄糖代谢的功能(赵亭亭等, 2018)，是蟹黄鲜虾酱甜味的主要贡献者；精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸虽然是苦味氨基酸，但对蟹黄鲜虾酱特殊的水产风味具有重要的贡献(Wang et al, 2015)。

实验组蟹黄鲜虾酱在25℃贮藏过程中呈味核苷酸及游离氨基酸的变化如表5 所示。GMP 和IMP 呈降低趋势，180 d 后，分别降至0.306 和0.156 g/100 g；AMP 含量先降后升，180 d 后，升至0.180 g/100 g；呈味核苷酸总量先降后升，180 d 与0 d 差异不显著。检出的16 种游离氨基酸，主要为谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丝氨酸和脯氨酸，占总游离氨基酸的78.13%。贮藏180 d后，16 种游离氨基酸含量均显著提高；游离氨基酸总量，鲜味和甜味氨基酸含量贮藏45 d 后显著升高。对照组蟹黄鲜虾酱贮藏180 d 后，GMP、IMP 和AMP降低幅度分别为10.7%、29.4%和26.7%，实验组GMP和IMP 降低幅度分别为8.8%和23.8%，而AMP 含量增加1.3 倍。GMP 是香菇和酵母的主要呈味物质，具有菌类特征风味(孙芝杨, 2011)，IMP 和AMP 是虾鲜味的特征呈味物质(李婉君, 2015)，且AMP 的甜滋味轮廓表现出来是独立的，使蟹黄鲜虾酱变得香甜可口。说明丁香油能有效抑制蟹黄鲜虾酱中主要呈虾蟹风味核苷酸的分解，从而对蟹黄鲜虾酱的主要风味起稳定和强化作用，与Milan(2006)的结论一致。从游离氨基酸方面来看，蟹黄鲜虾酱主要呈味物质是谷氨酸，丁香油对其贮藏过程中的变化没有显著影响。蟹黄鲜虾酱贮藏180 d 后，除了丙氨酸和赖氨酸，其余游离氨基酸含量在添加丁香油酱制品中均比不添加高，其中，对丝氨酸和蛋氨酸影响最大。蛋氨酸是酱制品挥发性风味物质中含硫化合物的前体物 (赵改名等, 2006)，对酱制品风味有影响(康旭等, 2011)。丁香油对蟹黄鲜虾酱的游离氨基酸的影响可能是通过抑制蛋白质的氧化，促进其向游离氨基酸方向的降解实现的。

表5 实验组蟹黄鲜虾酱贮藏过程呈味核苷酸及游离氨基酸组成的变化(g/100 g)Tab.5 The changes of taste nucleotides and free amino acids during storage of test crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

2.5 蟹黄鲜虾酱贮藏过程滋味强度值(TAV)及味精当量(EUC)的变化

TAV 是评价食品中单一组分的滋味强度及对整体风味贡献最经典和客观的方法(王曜等, 2014)，TAV 值越大，说明该物质对食品滋味贡献越大。对照组和实验组蟹黄鲜虾酱贮藏过程呈味物质的滋味强度值变化如表6～表7 所示。GMP、IMP 和谷氨酸是蟹黄鲜虾酱中最主要的呈鲜味物质。

表6 对照组蟹黄鲜虾酱呈味物质的阈值和贮藏过程滋味强度值、味精当量的变化(g/100 g)Tab.6 The changes of TAV and EUC during storage of control crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

表7 实验组蟹黄鲜虾酱呈味物质的阈值和贮藏过程滋味强度值、味精当量的变化(g/100 g)Tab.7 The changes of TAV and EUC during storage of test crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

EUC 可衡量鲜味氨基酸与呈味核苷酸混合产生的协同效应。对照组和实验组蟹黄鲜虾酱贮藏过程味精当量的变化如表6～表7 所示。随着贮藏时间的延长，对照组和实验组EUC 呈先下降后上升的趋势，贮藏180 d 时，分别达到304.50 g 和389.58 g MSG/100 g，说明添加丁香油，对蟹黄鲜虾酱的鲜甜味有提升作用。

3 结论

丁香油在蟹黄鲜虾酱贮藏过程中，能抑制丙二醛生成、总巯基降低和不饱和脂肪酸的分解，对蟹黄鲜虾酱贮藏过程中呈味核苷酸总量、鲜味氨基酸、甜味氨基酸和游离氨基酸总量也有显著提高的作用，使酱制品的味精当量显著高于不添加丁香油的酱制品。说明丁香油在蟹黄鲜虾酱贮藏过程中，不仅具有抗脂肪和蛋白质氧化的作用，还能提高蟹黄鲜虾酱的贮藏稳定性和风味。