清热解毒、散风除翳法对细菌性角膜炎的作用机制研究

白玉玲 安坤杰 李兴双

摘要 目的：观察清热解毒、散风除翳法对细菌性角膜炎模型鼠的疗效及其作用机制。方法：将60只Wistar大鼠随机分为5组，即模型组、小剂量组、大剂量组、对照组以及空白组，每组12只大鼠。采用细菌性角膜炎动物模型症状评定观察清热解毒、散风除翳法的疗效，通过细菌清除率、角膜细菌菌落计数，光学显微镜观察大鼠角膜的病理组织学改变，并采用流式细胞仪检测CD4+，CD8+及CD4+/CD8+的水平讨论清热解毒、散风除翳法的作用机制。结果：1）清热解毒、散风除翳法可降低细菌性角膜炎性反应状评分，提高细菌清除率，改善角膜基质层的病理结构;2）清热解毒、散风除翳法可提高细菌性角膜炎模型鼠外周血血CD4+、CD8+的表达水平，具有剂量依赖性（P<0.05），CD4+/CD8+比值相对稳定，各组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论：清热解毒，散风除翳法能有效改善细菌性角膜炎，其作用机制可能与上调大鼠外周血中CD4+，CD8+含量有关。

关键词 清热解毒，散风除翳法;细菌性角膜炎;实验研究;作用机制;流式细胞

Abstract Objective：To observe the therapeutic effect and mechanism of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating therapy on bacterial keratitis model mice. Methods：A total of 60 Wistar rats were randomly divided into 5 groups：model group（n=12），low dose group（n=12），high dose group（n=12），control group（n=12）and blank group（n=12）.The curative effect of clearing heat and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating was observed by evaluating the symptoms of the animal model of bacterial keratitis. The pathological and histological changes of rat cornea were observed by bacterial clearance rate， bacterial colony count of cornea and light microscope. The levels of CD4+， CD8+ and CD4+/CD8+ were detected by flow cytometry to discuss the mechanism of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating. Results：1）The method of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating could reduce the symptom score of bacterial keratitis， increase the bacterial clearance rate and improve the pathological structure of corneal stroma. 2）The method of heat-clearing and detoxification and wind-dispelling and nebula-eliminating could increase the expression level of CD4+ and CD8+ in peripheral blood of bacterial keratitis model rats in a dose-dependent manner（P<0.05），and the ratio of CD4+/CD8+ was relatively stable， and there was no significant difference among the five groups（P>0.05）. Conclusion：The method of clearing heat and detoxification， wind-dispelling and nebula-eliminating can effectively improve bacterial keratitis， and its mechanism may be related to the up-regulation of CD4+，CD8+ content in peripheral blood of rats.

Keywords Clearing away heat and detoxification;Wind-dispelling and nebula-eliminating; Bacterial keratitis; Experimental study;Mechanism of action;Flow cytometry

中图分类號：R285.5;R276.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.012

细菌性角膜炎是以角膜上皮缺损及缺损区下角膜基质坏死为主要病理变化的由细菌感染引起的眼病，是致盲的主要原因之一[1]。目前研究可知约87%[2-5]的细菌性角膜炎是感染细球菌科、链球菌科、假单胞菌科，肠杆菌科这4种致病菌引起的，抗生素治疗是目前的主要手段，然而我们发现由于细菌耐药性等因素导致兼具安全性和有效性的滴眼液的选择尚存在较大争议[6-8]。

中医学并无细菌性角膜炎的病名记载，其属于“凝脂翳”的范畴，首载于《证治准绳·杂病·七窍门》，在《审视瑶函·凝脂翳症》一书中对此病的病因病机进行详细的阐述，风热邪毒侵袭机体，黑睛被染，外邪入里化热，热毒壅盛于里，影响气机布散，壅滞蓄腐，黑睛溃陷而发此病。因此“清热解毒，散风除翳”是治疗本病的关键，在临床中我们证实该疗法确对细菌性角膜炎有理想疗效，但其作用机制尚不明了，故我们利用细菌性角膜炎大鼠模型为媒介，以期探明清热解毒，散风除翳法治疗细菌性角膜炎的可能机制，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 本次实验所使用的动物均选择清洁级的健康Wistar大鼠共60只（购于河北医科大学动物中心），每只Wistar大鼠的体质量（200±10）g，雌雄各30只，在进行本次实验之前，所有的Wistar大鼠都进行外眼检查，在确保未发现异常的Wistar大鼠方可入选本研究。饲养环境：温度（25±1.5）℃，湿度（50±5）%，12 h/12 h昼夜交替。

1.1.2 药物 清热解毒，散风除翳法的中药制剂均由河北医科大学第四医院药房提供及煎煮，金银花、天花粉、荆芥、防风、蒲公英、生地黄、黄芩、赤白芍、蝉蜕、白蒺藜、甘草组方上述11位中药按一定比例配伍后，放置入煎煮器皿中，先用武火煎开后再使用文火煎煮约10 min，之后倒出药液进行过滤，再将药液进行加热，使其浓缩至含生药4.6 g/mL，自然冷却后装入密封瓶中以备用。

1.1.3 试剂与仪器 金黄色葡萄球菌标准菌株（广东环凯微生物科技有限公司，产品ID号：VLK-091585）;血平板培养基（广东环凯微生物科技有限公司，货号：024070）;CD4+流式细胞试剂盒（ThermoFisher Scientific有限公司，货号：MA5-16134），CD8+流式细胞试剂盒（ThermoFisher Scientific有限公司，货号：MA5-16802）;外周血淋巴细胞分离液试剂盒（Solarbio有限公司，货号：P8630）;台湾赫罗斯手持裂隙灯（北京泽澳医疗科技有限公司，中国，型号：ILS100），赛多利斯分析天平（苏州金钻称重设备系统开发有限公司，型号：BSA124S），轮转切片机（山东博科科学仪器有限公司，型号：BK-2178）;病理图像分析仪（同济医科大学影像公司，型号：HPIAS-1000）;万能照相机（Olympus公司，日本，型号：AHB-2-LB）;流式细胞仪（贝克曼公司，美国，型号：CytoFLEX）。

1.2方法

1.2.1 分组与模型制备 将60只Wistar大鼠随机分为5组，即模型组、小剂量组、大剂量组、对照组、以及空白组，每组12只大鼠。菌落制备：本次实验菌株选用金黄色葡萄球菌标准菌株，菌种浓度设定为2.5×1010 CFU/mL;在合适的生物安全防护条件，用吸管将0.5 mL普通琼脂培养基注入金黄色葡萄球菌冻干粉安瓶中，吹打使其溶解成金黄色葡萄球菌悬液，在使用前的24 h将菌悬液接种于的血培养基并放置在37 ℃的恒温箱进行培养，之后用0.45%的无菌NaCl溶液进行稀释，经细菌浓度比浊仪将其比浊为2 MC Farlands（约含6亿CFU/mL）后备用。模型制备：除空白组大鼠外，其余4组大鼠均使用10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉（麻醉剂量为每100 g体质量0.3 mL），之后根据Hobden[9]接种法，在各组大鼠的眼角膜上滴1%盐酸丁卡因滴眼液1滴进行眼部的麻醉，并将7号注射无菌针头在大鼠角膜中央轻划3条相互平行约2 mm长度划痕，深度使其达到角膜的浅基质层，将制备好的菌液用移液器滴在角膜划痕上，20 μL/次，共滴3次[10]。24 h后采用手持裂隙灯、手电筒等工具对患眼进行观察，当出现角膜浑浊及结膜明显充血即为造模成功。

1.2.2 给药方法 大鼠处理24 h后开始干预治疗，空白组：不给药;模型组：不给药;小剂量组：按10倍成人剂量具有清热解毒，散风除翳法的中药对大鼠进行灌胃给药治疗;大剂量组：按20倍成人剂量具有清热解毒，散风除翳法的中药对大鼠进行灌胃给药治疗;对照组：经过蒸馏水配制的阿莫西林胶囊水溶液，按成人剂量的20倍对大鼠灌胃给药治疗;3个观察组患眼局部均采用0.5%左氧氟沙星滴眼液滴眼（4次/d），红霉素眼膏涂眼（1次/d）进行外用药治疗。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 细菌性角膜炎动物模型症状评定 分别于给药前、给药2 d、给药8 d、给药14 d，采用手持裂隙灯、手电筒灯工具对患眼进行观察，并根据表1的细菌性角膜炎动物模型症状评分标准，进行症状评分以此作为统计数据。

1.2.3.2 细菌清除率 分别在给药前、第2、8、14天对Wistar大鼠的眼角膜进行细菌菌株数的鉴定。将无菌棉签浸润无菌NaCl溶液对各组模型大鼠的上下眼睑进行擦拭，后将擦拭过的棉签放入无菌试管中，并装入5 mL无菌NaCl溶液，充分浸泡摇匀，使用无菌注射器抽取0.5 mL液体放置于无菌培养皿之中与琼脂培养基混合均匀，将培养皿放置在37 ℃的培养箱中，持续培养18 h，以观察细菌清除率。细菌清除率的计算公式：细菌清除率=清除株/感染眼数×100%。

1.2.3.3 角膜细菌菌落计数 处死各组Wistar大鼠后，均摘取左侧眼球，取下左眼的角膜，将角膜放置于10 mL无菌NaCl溶液的无菌试管中，并配置成3组浓度不同的菌液（浓度分别为1∶10、1∶100、1∶1 000），各比例的菌液抽取1 mL与15 mL灭菌消毒后的普通营养琼脂混匀，放置入无菌培养皿中，置于37 ℃的恒溫箱中进行培养，在培养24 h进行菌落的分析计数。

1.2.3.4 光学显微镜观察 处死各组Wistar大鼠后，均摘取右侧眼球，放置在10%福尔马林中进行石蜡包埋，后将其以3 μm石蜡切片，分别进行HE染色，在40×10倍光学显微镜下观察大鼠角膜的病理组织学改变，每张经过处理的病理切片分别选取10个视野（包括中央与周边），并将其分别进行摄片取样，在彩色病理图像分析系统下进行分析，在观察的同时进行多形核白细胞（PMN）的计数分析，然后取其各切片的均值进行PMN的半定量分析。

1.2.3.5 CD4+，CD8+，以及CD4+/CD8+的检测   每组Wistar大鼠在处死活检前，分别抽取其外周静脉血2 mL，进行EDTA抗凝，分离出大鼠淋巴细胞分离液，再从中提取外周单核细胞共200 μL，把所提取的外周单核细胞置于盛有10%的胎牛血清的培养基中，置于37 ℃环境下培养24 h后，再放置于5%CO2环境下培养4 h，培养结束后，进行PBS冲洗，细胞收集，随后将细胞使用SD流式仪细胞学检测CD4+，CD8+，以及CD4+/CD8+，上述所有的操作流程均按相关操作说明书严格进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。评分数据用均数±标准差（±s）表示，2样本均数比较用t检验，多样本均数比较用单因素方差分析，若差异有统计学意义，采用最小显著差异法做两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细菌性角膜炎的症状评分 治疗前各组大鼠眼部混合充血加剧各组症状平差异无统计学意义。治疗后第2天，模型组、治疗小剂量组、治疗大剂量组和治疗对照组的症状评分均高于空白组（P<0.05），但4组间差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后第8天，治疗大剂量组、治疗小剂量组、治疗对照组的症状评分明显低于模型组（P<0.05），高于空白组（P<0.05），其中治疗大剂量组、治疗小剂量组的症状评分均较治疗对照组低（P<0.05），尽管治疗大剂量组的症状评分较治疗小剂量组评分更低，但差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后第14天，治疗大剂量组、治疗小剂量组、治疗对照组3组的症状评分进一步降低且均低于模型组（P<0.05），高于空白组（P<0.05）;治疗大剂量组、治疗小剂量组、治疗对照组3组间症状评分差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2 各组细菌清除率比较 在实验的第2、8、14天对各组的细菌清除率进行观察，结果显示，第2天治疗大剂量组、治疗小剂量组与治疗对照组之间的细菌清除率差异无统计学意义（P>0.05）;第8天，治疗对照组的细菌清除率为46.1%，治疗小剂量组的细菌清除率为55.2%，而治疗大剂量组为72.8%，均明显高于模型组的14.9%，差异有统计学意义（P>0.05）;在第14天，治疗对照组细菌的清除率为62.7%，治疗小剂量组为71.1%，治疗大剂量组为85.7%，也均明显高于模型组（15.9%）（P<0.05）。

2.3 各组菌落计数比较 分别对各组大鼠的角膜菌落计数进行统计分析，结果表明：模型组大鼠的角膜菌落计数均高于治疗对照组、治疗小剂量组和治疗大剂量组，且模型组与各组的技术差异有统计学意义（P<0.05），而空白组的角膜菌落计数均低于治疗对照组、治疗小剂量组和治疗大剂量组，但差异无统计学意义（P>0.05）、其中角膜菌落计数由高到低分别为治疗对照组、治疗小剂量组、治疗大剂量组，且各组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 光学显微镜下观察角膜组织中多形核白细胞的半定量分析 模型组较之空白组，其角膜基质层水肿更为明显，且出现了空腔和前上皮的增生，角膜明显增厚，可见明显炎性浸润，伤口周围可见大量的主治坏死，深及一半的基质，胶原纤维明显肿胀，并可见大部分角膜上皮出现剥脱、变性。见图1。而其余的治疗对照组、治疗小剂量组与治疗大剂量组镜下所见发生感染的角膜，其炎性浸润与肿胀程度较轻，角膜未见明显剥脱、变性，结构趋于完整。对角膜组织中的PMN进行半定量分析，结果显示，治疗大剂量组、治疗小剂量组的PMN均低于治疗对照组，差异有统计学意义（P<0.05），同时治疗小剂量组与治疗对照组的PMN量也均低于模型组（P<0.05）。但治疗大剂量组、治疗小剂量组、治疗对照组虽高于空白组，但各组间进行比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.5 各组大鼠外周血的CD4+、CD8+水平比较   治疗小剂量组、治疗大剂量组血CD4+、CD8+的表达水平明显高于治疗对照组、模型组和空白组（P<0.05），其中治疗大剂量组与治疗小剂量组之间比较，以及空白组、治疗对照组和模型组之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）;CD4+/CD8+比值相对稳定，5组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表5。

3 讨论

细菌性角膜炎是临床常见的严重威胁视力的眼科疾病之一，以眼痛、畏光、结膜充血、异物感、分泌物增多为主要临床表现，是致盲的重要原因，该病发病急、进展迅速、变化多端，严重影响患者的生命质量[12]。在常见的致病菌中金黄色葡萄球菌是致病力最强的菌种[13-15]，其产生的金黄色色素对甘露醇有较强的分解能力，金黄色葡萄球菌在生长过程中合成并分泌到外毒素，诱发产生血浆凝固酶、溶血毒素、杀白细胞素等[16-17]，入侵角膜导致局部产生炎性反应效应。目前临床显示广谱抗菌药对该病具有一定疗效，而长时间抗生素滴眼液点眼，会使患者产生抗药性，导致患者对药物的敏感性降，而且这类眼液均具有程度的上皮毒性，长期使用可导致干眼症[18]，此外，随着耐药菌株的不断出现，临床细菌培养及药敏结果的滞后，往往导致感染得不到及时控制，延误病情。

中医研究认为该病的病机黑睛外伤，风热邪毒乘伤袭入，黑睛被染，外邪入里，蕴遏化热，应该使用清热解毒，散风除翳法对细菌性角膜炎进行治疗。本研究药方由金银花、天花粉、荆芥、防风、蒲公英、生地黄、黄芩、赤白芍、蝉蜕、白蒺藜、甘草组成，其中金银花是清热解毒明目的经典中药，现代研究显示金银花的药理活性成分有明显抑制金黄葡萄球菌的作用[19]。防风、荆芥可祛风散邪止痛，符合“火郁发之”之意;蒲公英、黄芩、蝉蜕可清肝泻火退赤，现代药理学研究显示黄芩苷有明显抗毒素作用;赤芍配生地黄共奏清热活血，退赤止痛的效应，白蒺藜有平肝解郁，祛风明目的作用，现代药理学研究显示甘草提取物有明顯提升机体免疫功能的作用[20]。经过对大鼠对金黄色葡萄球菌引起的细菌性角膜炎的实验研究表明，清热解毒，散风除翳法中药结合西医抗生素治疗本病能改善大鼠炎性反应角膜的外眼形态，提高细菌清除率，降低炎性反应角膜中PMN浸润数目及细菌菌落数量，升高外周血中CD4+、CD8+含量，提高机体免疫力，从而加快炎性反应消除，缩短溃疡愈合时间。提示中西医结合是一种疗效确切、安全无不良反应的治疗细菌性角膜炎的方法，不良反应小，安全可靠，而且治愈时间大大缩短，患者的治愈率也有明显提高，可安全应用于临床，值得进一步的推广和探究。

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（2019-09-27收稿 责任编辑：王明）