基于网络药理学探讨半夏泻心汤治疗糖尿病胃轻瘫胃排空延迟的作用机制

徐婷婷 崔国良 冯小可 谢立群

摘要：目的  基于網络药理学方法分析半夏泻心汤的关键活性成分治疗糖尿病胃轻瘫（DGP）胃排空延迟的作用机制。方法  利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）获取半夏泻心汤的主要活性成分及其对应的作用靶点，在人类基因数据库（GeneCards）中搜索DGP胃排空延迟相关的靶点，利用Cytoscape3.7.1软件构建中药活性成分-靶点网络，运用STRING数据库构建蛋白相互作用（PPI）网络，利用DAVID6.8在线工具进行靶点的GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果  筛选出半夏泻心汤复方中的152个活性成分，作用于108个靶点，其中关键靶点21个，包括AKT1、ESR1和STAT3等。GO功能分析共获得392条富集结果，其中，生物过程主要涉及对药物的反应，对凋亡、蛋白磷酸化和基因表达的调控等299条;分子功能涉及酶结合、蛋白结合、细胞因子活性等37条;细胞组分涉及细胞质、细胞外区域、线粒体和细胞核等56条。KEGG分析结果显示，TNF、HIF-1和PI3K-Akt等信号通路与半夏泻心汤治疗DGP胃排空延迟密切相关。结论  本研究初步揭示半夏泻心汤治疗DGP胃排空延迟是多成分、多靶点和整体调节的复杂过程，为后续研究提供新的理论依据。

关键词：网络药理学;半夏泻心汤;糖尿病胃轻瘫;信号通路;靶点

中图分类号：R259;R285    文献标识码：A    文章编号：2095-5707（2020）05-0007-07

DOI： 10.3969/j.issn.2095-5707.2020.05.002

Abstract： Objective To explore the core active components and targets of Banxia Xiexin Decoction and the possible mechanism of treating delayed gastric emptying in diabetic gastroparesis based on network pharmacology. Methods Major active components and corresponding target genes of Banxia Xiexin Decoction were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology （TCMSP）， and the target genes of diabetic gastroparesis were obtained by GeneCards. Cytoscape3.7.1 software was used to construct the active components-target network of TCM. The network of protein interaction （PPI） was constructed by using STRING database. The DAVID6.8 online tool was used for the gene ontology （GO） analysis and kyoto encyctopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of target genes. Results Totally 152 activecomponents of Banxia Xiexin Decoction were selected， which acted on 108 targets， 21 of which were key targets， involving AKT1， ESR1 and STAT3. GO functional analysis obtained a total of 392 enrichment results. Among them， the biological process mainly involved 299 items such as response to drugs， regulation of apoptosis， protein phosphorylation and gene expression， etc.; molecular functions involved 37 items such as enzyme binding， protein binding， and cytokine activity; cell components involved 56 items including cytoplasm， extracellular area， mitochondria and nucleus. KEGG results showed that signal pathways such as TNF， HIF-1 and PI3K-Akt were closely related to delayed gastric emptying in diabetic gastroparesis treated by Banxia Xiexin Decoction. Conclusion This study preliminarily reveals that Banxia Xiexin Decoction for delayed gastric emptying in diabetic gastroparesis is a complex process with multiple components， multiple targets and overall regulation， which provides a new theoretical basis for the follow-up studies.

Key words： network pharmacology; Banxia Xiexin Decoction; diabetic gastroparesis; signaling pathways; targets

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种严重危害人类健康的代谢性疾病。资料显示，5年以上糖尿病病史的患者中约有50%的患者会伴发糖尿病胃轻瘫（Diabetic Gastroparesis，DGP）[1]。DGP属于一种糖尿病胃肠植物神经病变，主要以胃排空延迟为特点，表现为早饱、腹胀、恶心、呕吐、上腹痛和体重减轻等，严重影响患者对食物和药物的消化吸收，加重糖代谢异常，使患者的生活质量明显下降，加重家庭的经济负担。因此，对于DGP的治疗至关重要。

西医治疗DGP的主要方法包括控制血糖、使用促胃肠动力药物，如新型选择性5-羟色胺（5-HT）4受体激动剂及多巴胺D2受体阻滞剂，及维持水电解质平衡等。但由于对DGP发病机制的认识尚不明确，目前临床上尚无其他有效治疗手段，且促胃肠动力药物存在QT间期延长、增加心脑血管不良事件或锥体外系反应等副作用，故需要探索新的治疗途径。近年来中医治疗DGP疗效显著，其中出自张仲景《伤寒论》的半夏泻心汤是临床治疗DGP的常用方剂之一。半夏泻心汤由半夏、黄芩、干姜、人参、黄连、大枣、炙甘草7味药物组成，具有调和肝脾、寒热平调、消痞散结之功。研究表明，半夏泻心汤能明显改善DGP患者的临床症状[2-3]，其主要机制包括：增加胃窦Cajal间质细胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）数量[4]，改善肠道菌群比例、抑制炎症因子的释放[5]，调节胃肠激素、降低血糖及改善胰岛素抵抗[6]等。目前对于半夏泻心汤改善DGP的主要活性成分、作用靶点及相关信号通路尚不明确，而网络药理学基于“药物-靶点-疾病”相互作用网络，能整体和系统研究中药的复杂成分及其相互作用，为中医药研究提供新思路。故本研究采用网络药理学研究方法，对半夏泻心汤治疗DGP的作用机制进行探讨，为后期实验提供研究方向和理论依据。

1  资料与方法

1.1  半夏泻心汤活性成分及靶点筛选

利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）获得各中药的活性成分及其作用靶点。根据口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18，筛选出半夏泻心汤的活性成分及其对应的靶点。利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）和美国国家生物技术信息中心数据库（NCBI，https：//www.ncbi. nlm. nih.gov），限定物种为人，将靶点转换为相应的基因名称。

1.2  DGP相关靶点筛选

在GeneCards数据库（https：//www.genecards. org）中，以“diabetic gastroparesis”和“delayed gastric emptying”为关键词，以关联系数≥5作为筛选标准，获得DGP疾病相关靶点。

1.3  半夏泻心汤治疗DGP潜在靶点预测

将半夏泻心汤活性成分对应的靶点与DGP相关靶点取交集，交集靶点可能是半夏泻心汤治疗DGP的潜在作用靶点。使用Cytoscape3.7.1软件构建中药活性成分-靶点网络。

1.4  蛋白相互作用网络构建

将“1.3”中筛选出的交集靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org），限定研究物种为“homo sapiens”，最低相互作用评分设置为最高置信度0.90，其余设置为默认值，将数据导入Cytoscape3.7.1软件，构建半夏泻心汤治疗DGP的蛋白相互作用（PPI）网络图。

1.5  GO功能富集和KEGG通路富集分析

在DAVID6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov）中输入“1.3”中筛选出的交集靶点，选择物种为“homo sapiens”，设定阈值P<0.01，进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，并将富集分析结果进行可视化处理。

2  结果

2.1  半夏泻心汤主要活性成分及其靶点

在TCMSP数据库中收集半夏泻心汤活性成分，根据OB≥30%和DL≥0.18的条件筛选后，得到半夏13个、大枣29个、甘草85个、干姜5个、黄连14个、黄芩36个、人参22个，去除重复后，共获得162个活性成分，对应靶点273个。

2.2  DGP相关靶点及半夏泻心汤活性成分-靶点网络

从GeneCards数据库中检索到DGP相关靶点532个。将其与活性成分对应的靶点取交集后，得到半夏泻心汤治疗DGP的预测靶点108个，对应152个活性成分。利用Cytoscape3.7.1软件构建半夏泻心汤活性成分-靶点网络（见图1）。该网络中有260个节点，其中活性成分节点152个、靶点基因节点108个，成分与靶点之间存在1192条相互作用连线。从图1可以看出，MOL000098（槲皮素）潜在靶点最多，为77个，其次分别为MOL000173（汉黄芩素）34个、MOL000422（山柰酚）25个。此外在网络中，前列腺素G/H合成酶（Prostaglandin G/H Synthase，PTGS）2靶点对应活性成分数目最多，为134个;其次为热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）90AA1和雌激素受体（Estrogen Receptor，ESR）1，分别有103和89个对应活性成分。该网络中约91.4%的活性成分至少与2个靶点相互作用，而64.2%的靶点同时接受≥2个活性成分的调控，说明半夏瀉心汤中的活性成分可能作用于整个网络系统中，不同的靶点可以接受1个或者多个活性成分的调控，形象地反映出中药作用的整体性和复杂性，体现中药“多成分-多靶点-多途径”的综合调节作用。

2.3  半夏泻心汤治疗DGP蛋白相互作用网络

将108个预测靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，PPI网络图见图2。网络中发生相互作用的靶点有103个，共有926条边，节点颜色越深，与其相连的边越多，度值越大。网络中各节点的平均度值为9.06，平均介数为0.016，平均中心度数为0.436。度、中心度数、介数均超过平均值的靶点有21个，详情见表1。

2.4  GO功能富集和KEGG通路富集分析

以P<0.01为筛选条件，在DAVID6.8数据库获得392条GO功能富集分析结果。其中，生物过程相关条目299条，主要涉及对药物的反应，对凋亡过程的负调节，对RNA酶Ⅱ启动子转录、蛋白磷酸化和基因表达的正向调控等方面;分子功能相关条目37条，主要涉及酶结合、蛋白结合、蛋白同源二聚化活性、细胞因子活性和蛋白异源二聚化活性等方面;细胞组分相关条目56条，主要涉及细胞质、细胞外区域、线粒体和细胞核等方面。GO功能富集结果中-log10 P值居前20位的条目见图3。

KEGG通路富集结果显示，108个靶点显著富集在121条通路上（P<0.01），有48条通路与DGP密切相关，前10条信号通路包括TNF信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体（T cell receptor，TCR）信号通路、Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路、Prolactin信号通路、P53信号通路、NOD-like receptor信号通路、ErbB信号通路，提示半夏泻心汤可能通过以上多条信号通路治疗DGP。KEGG通路富集显著性（P值）最强的20条通路见图4。

3  讨论

祖国医学认为糖尿病胃轻瘫属“消渴”合并“痞满”“呕吐”“胃痛”等范畴，其病位在脾胃，多因消渴日久，耗伤气阴，气损血瘀，脾胃升降失和，纳运失权，以致痞满不舒，湿热内蕴，寒热互结于心下。半夏泻心汤全方寒热互用以和阴阳，苦辛并进以调其升降，补泻兼施以顾其虚实，具有清热除痞、健运脾胃之功。

本次研究获得半夏泻心汤治疗DGP对应活性成分152个，其中具有潜在靶点较多的是槲皮素、汉黄芩素和山柰酚，都是天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和降糖等作用[7]。糖尿病患者处于高氧化应激状态，正常的抗氧化调节机制受损，导致ICC数量减少、超微结构异常，进而加重胃排空延迟。同时高血糖会抑制神经元，诱导细胞氧化损伤，从而影响激素水平[8]。另外，炎症也是加重DGP患者胃排空延迟的重要原因之一，其中TNF-α、 IL-6、IL-10起着至关重要的作用[9]。现代药理研究发现，槲皮素能直接消除活性氧（ROS）自由基，起到抗氧化作用，改善胰岛素抵抗和增强胰岛素的敏感性[10-11]，降低炎症因子分泌[12]。山柰酚能通过抗氧化，抑制醛糖还原酶减轻2型糖尿病大鼠的并发症[13];同时降低血糖，改善胰岛素敏感性和糖脂代谢紊乱[14]，并调节促炎酶的活性和炎症相关基因的表达[15]。汉黄芩素能消除ROS自由基，抑制多种酶类活性和脂质氧化过程[16]。故综合此次分析预测及相关研究结果，推测半夏泻心汤治疗DGP胃排空延迟的作用机制可能为通过抗氧化应激、调节胰岛素敏感性和抗炎等途径改善糖尿病患者状态，恢复胃平滑肌的正常生理功能。

通过对靶点的进一步分析发现，PTGS2、HSP90AA1和ESR1与DGP的发生、发展有着密切的关系。其中PTGS也称环氧化酶（COX），是花生四烯酸合成前列腺素过程中的关键酶，催化合成的前列腺素可以保护胃肠道并调节胃肠运动。研究发现，下调COX-2能减轻炎症反应且COX-2抑制剂能明显改善DGP大鼠的胃排空延迟[17-18]。HSP90在多种应激状态下诱导产生，是真核细胞参与细胞保护作用的重要蛋白之一。有研究发现，DGP患者胃组织存在微血管病变，微血管管壁迂曲厚薄不一，甚至连续性中断[19]，而HSP90能诱导一氧化氮合酶（NOS）合成一氧化氮（NO）[20]，从而发挥保护血管内皮和扩张血管的功能，并能抑制血小板聚集粘附和平滑肌细胞增殖，在糖尿病微血管病变中起到关键作用[21]。ESR1编码的雌激素受体（ER）α既能调控雌激素的水平，也是激活配体的转录因子。糖尿病患者中超80%为女性，有明显的性别差异[22]。相关研究表明，女性糖尿病患者发生胃轻瘫时伴有体内雌激素水平降低及胃NO新号通路受损[23]。另有研究表明，DGP大鼠幽门部ER水平上调，雌激素能通过抗氧化应激保护自主神经、维持NO信号通路，从而改善DGP引起的胃排空延迟[24]。综合以上分析预测结果及相关研究结果，推测半夏泻心汤可能通过作用于多个靶点来抑制COX-2、促进NO合成和调控雌激素水平，从而促进胃排空，改善DGP患者消化系统症状。

GO功能富集分析发现，半夏泻心汤治疗DGP主要体现在对药物的反应，对凋亡、蛋白磷酸化和基因表达等过程的调节，涉及酶结合、蛋白结合和细胞因子活性等方面，主要对细胞质、细胞外区域、线粒体和细胞核等细胞组分起作用。研究发现，DGP患者胃窦平滑肌细胞出现细胞缩小、胞核不规则、线粒体肿胀、缝隙连接破坏和膜外基层增厚等病理改变[25]，经半夏泻心汤治疗后能改善这种胃平滑肌受损的超微结构，恢复其原有功能[26]，这与GO分析预测结果一致。

KEGG通路富集分析发现，48条通路与DGP发病密切相关。其中TNF和NF-κB信号通路是经典的炎症相关通路，动物实验显示，半夏泻心汤能抑制TNF和NF-κB信号通路的激活，显著降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达和升高抑炎因子IL-10的表达，改善DGP大鼠胃动力障碍[27]。半夏泻心汤的主要活性成分之一——槲皮素可减弱TNF-α对骨骼肌细胞的损伤，并通过Akt和MAPK等通路使骨骼肌细胞增加对葡萄糖的摄取及增强胰岛素敏感性，从而改善2型糖尿病并发症[28]。槲皮素和山柰酚能通过抑制NF-κB信号通路降低诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、C-反应蛋白（CRP）、COX-2蛋白和基因的表达，从而起到抗炎作用[29]。PI3K-Akt信号通路是胰岛素信号传导途径之一，可调控葡萄糖稳态和脂质代谢[30]，汉黄芩素通过PI3K-Akt信号通路促进胰岛素分泌和骨骼肌对葡萄糖的摄取与利用，从而降低血糖[31]。TLR信号通路在高脂高糖条件下激活后会促进炎症因子的表达和加重胰岛素抵抗[32]，槲皮素可通过上调TLR的负调节因子Tollip的表达来抑制由脂多糖诱导的细胞表面分子CD80、CD86等的表達和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生[33]。综合以上分析预测结果及相关研究结果，推测半夏泻心汤能通过作用于多个信号通路来发挥作用，其具体相关机制有待实验的进一步验证。

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（收稿日期：2020-07-08）

（修回日期：2020-07-24;编辑：郑宏）