miR-27a rs895819(T>C)的基因多态性与广东地区冠心病遗传易感性的关系 *

熊卿圆，岑锦明，熊兴东，曾赤佳

1.广东省佛山市禅城区中心医院检验科，广东佛山 528000；2.广东省佛山市第一人民医院心血管内科，广东佛山 528000；3.广东医科大学衰老研究所，广东东莞 523808

随着我国人口老龄化趋势的加快以及人们生活、饮食习惯的改变，心血管疾病的发病率和病死率呈逐年上升及年轻化趋势，已成为导致我国成年人住院和死亡的首要原因。而冠心病在广东地区的发病率也呈逐年升高趋势。目前已经证实的引起冠心病的主要危险因素包括高血压、吸烟、血脂异常、糖尿病、年龄、性别、超重和肥胖等。研究发现，微小核糖核酸(miRNA)的单核苷酸多态性(SNP)会影响成熟miRNA的表达，或引起靶基因表达的改变[1]。有研究表明，miRNA在动脉粥样硬化斑块形成、心肌梗死后心肌细胞坏死及凋亡、缺血性心律失常、心肌梗死后的血管再生及心肌重构、血管内皮细胞损伤与衰老等冠心病的病理生理过程中发挥了重要的作用[2]。这提示miRNA的基因多态性(以下简称多态性)可能与冠心病的遗传易感性密切相关。本研究前期结果(尚未发表)显示，携带miR-27a rs895819 C等位基因的个体在冠心病患者中的分布频率为21.4%，对照组中rs895819 C等位基因的分布频率为27.7%，差异有统计学意义(OR=1.21，95%CI=1.02～1.50，P=0.013)。另外，没有发现其余8个多态性位点与广东地区冠心病的遗传易感性具有相关性。本研究采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)技术检测miR-27a rs895819(T>C)多态性位点基因型在广东佛山地区冠心病患者及对照人群中的分布情况，以验证及深入研究其遗传易感性的分子机制，并进一步阐明该多态性位点对冠心病遗传易感性的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究采用病例对照研究方法。随机收集2016年6月至2019年7月在广东省佛山市禅城区中心医院治疗，并经冠状动脉造影等检查确诊为冠心病的563例患者作为病例组研究对象。冠心病均符合国际心脏病学会及WHO《缺血性心脏病的命名及诊断标准》中相关诊断标准。收集经心脏核素扫描、冠状动脉CT成像或冠状动脉造影等检查排除冠心病的650例对照者作为对照组研究对象。所有冠心病患者和对照者均无血缘关系，排除先天性心脏病、充血性心力衰竭、周围血管疾病、风湿性心脏病、肺源性心脏病、慢性肾病、肝病或恶性肿瘤。每例研究对象都记录年龄、性别、吸烟史、血压，以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油水平等一般资料。在标本采集过程中，所有研究对象在入选时均被告知研究方法及意义，做到知情同意。本研究得到了广东省佛山市禅城区中心医院医学伦理委员会的批准。

1.2仪器与试剂 TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒(TianGen)，Thermo Nano Drop2000 DNA检测仪，Mastercycler®ep PCR仪，ABI PRISM 3730 DNA测序电泳仪(ABI)。

1.3方法

1.3.1基因组DNA抽提 每例研究对象取静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，按照TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取外周血基因组DNA，紫外分光光度计检测水平为40 ng/μL以上，A260/A280为1.7～1.9方可进行后续试验。标本于-80 ℃保存备用。

1.3.2基因分型 采用PCR-LDR方法对miR-27a rs895819(T>C)进行基因分型。采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物。PCR反应的上游引物为5′-GCA AGG CCA GAG GAG GTG AG-3′，下游引物为5′-GTG CCT GGC CTG AGG AGC AG-3′。探针序列：rs895819-modify探针为P-CCA AGT CGT GTT CAC AGT GGT TTT TTT TTT TTT TTT TT-FAM；rs895819-T探针为5′-TTT TTT TTT TTT TTT TGC TGC TTG TGA GCA GGG TCC ACA-3′；rs895819-C探针为5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT GCT GCT TGT GAG CAG GGT CCA CG-3′。采用20 μL多重PCR反应体系，反应程序：95 ℃预变性15 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共35次循环，最后72 ℃延伸7 min。3%琼脂糖凝胶电泳检测，观察PCR产物，确定其作为模板在连接酶检测反应(LDR)中加入的量，扩增目标片段长度为110 bp。LDR反应体系为10 μL，95 ℃ 2 min预变性,94 ℃变性15 s，50 ℃反应25 s，共40次循环。产物经ABI 3730测序仪测序，结果运用Gene Mapper 4.0软件进行分析。

2 结 果

2.1病例组和对照组的一般资料对比 两组之间年龄、性别、总胆固醇水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。其他变量的均数或分布在两组间均差异有统计学意义(P<0.05)。冠心病患者高血压、高脂血症和糖尿病患病率较高，三酰甘油和LDL-C水平较高，HDL-C水平较低。见表1。

2.2miR-27a rs895819(T>C)基因型的分布及Hardy-Weinberg平衡检验 外周血DNA PCR扩增，随机取3份标本及空白对照进行电泳，提示PCR成功。miR-27a rs895819(T>C)多态性位点的电泳测序分型结果见图1。病例组和对照组中等位基因和基因型分布见表2。miR-27a rs895819(T>C)多态性的基因型分布频率在对照组中分别为56.8%(CC)、37.3%(CT)和5.9%(TT)。Goodness-of-fixχ2检验表明该多态性位点在对照人群中具有群体代表性，观察到的基因型分布没有偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表1 病例组和对照组的一般资料对比

注：该图为LDR测序结果，为非连续的常规坐标图；TC基因型为双峰；TT、CC基因型为单峰；73～77 bp代表该基因在所测序的整条序列上的相对位置；曲线代表检测到的信号；SZ即确切的相对位置值；ht为检测到的信号强度。

表2 miR-27a多态性等位基因和基因型在两组中的分布[n(%)]

2.3miR-27a rs895819多态性与冠心病遗传易感性的关系 对可能的混杂因素(年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症)进行校正后，miR-27a rs895819 TT、CT、CC基因型在病例组中的分布频率分别为5.7%、38.0%，56.3%，对照组分别为5.9%、37.3%、56.8%，两组基因型分布差异无统计学意义(χ2=4.212，P=0.578)。非条件Logistic回归发现，以TT基因型作为参照，CT和CC基因型均与冠心病无相关性(OR值分别为1.29、1.28，95%CI分别为0.58～2.76和0.57～2.60)。等位基因分析结果也显示，携带miR-27a rs895819 C等位基因与冠心病的遗传易感性无明显相关性(OR=0.94,95%CI=0.72～1.27,P=0.518)。

3 讨 论

miR-27a是从hela细胞中克隆得到的，pre-miR-27a的常见多态性位点rs895819已被报道与2型糖尿病(T2DM)[3]和多种癌症的风险显著相关[4]。最初的研究可以追溯到YANG等[5]报道rs895819的变异可能抑制miR-27a的成熟，从而与家族性乳腺癌风险相关。

脂质代谢障碍是冠心病的常见危险因素。miR-27a不仅为致癌miRNA，还通过改变许多脂质代谢相关基因的表达来调控脂质代谢，如抑制胆固醇调节元件结合蛋白1、胆固醇调节元件结合蛋白2、过氧化物酶体增殖剂激活受体α、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ、载脂蛋白A1、载脂蛋白B100和载脂蛋白E等基因的表达[6]。最近对脂质代谢中miRNA的研究也表明，miR-27a是胆固醇生物合成的关键调控因子[7]，它还能通过靶向调节白细胞介素-10(IL-10)相关通路，保护心肌细胞在缺氧/再灌注损伤过程中不被线粒体介导的凋亡所影响。

此外，miR-27a在内皮细胞功能障碍过程中发挥着独特的作用，可能导致动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等心血管疾病的发生[8]。URBICH等[9]证明，miR-27a通过靶向调节信号素6A(SEMA6A)促进血管生成，诱导邻近内皮细胞发生排斥反应。此外，miR-27a已被证明与肾素-血管紧张素系统(RAS)相关，并通过靶向调节人类血管紧张素转换酶(ACE)基因影响高血压患者的心血管稳态和抗动脉粥样硬化机制。这些研究表明，miR-27a在不同的状态下具有多种功能，可能参与心血管疾病的发生、发展。

有研究表明，miR-27a rs895819的SNP与多种癌症相关[10]，而miR-27a前体rs895819(G>A)在我国汉族人群中与冠心病的遗传易感性存在相关性[11]。本研究评估了miR-27a rs895819多态性中的另一多态性位点T>C对冠心病的影响，前期试验提示该多态性位点的C等位基因可能为预防冠心病的保护基因。本研究结果提示miR-27a rs895819(T>C)多态性与广东佛山地区人群的冠心病发生没有关联性。可能该结果需要更大的样本量来验证其与遗传易感性的关系，且miR-27a及其靶点调控心肌梗死发生和发展的机制尚不清楚，在对miR-27a rs895819多态性和冠心病之间的联系进行功能评估之前，可能还需要进行更多的研究。